苗药血人参的质量标准研究Δ

朱新宇，骆瀚超，何茂秋，胡朝阳，梁　妍，郝小燕（贵州医科大学药学院，贵阳　550025）

·药物分析与检定·

苗药血人参的质量标准研究Δ

朱新宇＊，骆瀚超，何茂秋，胡朝阳，梁妍，郝小燕#（贵州医科大学药学院，贵阳550025）

目的：建立苗药血人参药材的质量标准。方法：鉴别药材性状和显微特征；采用薄层色谱法（TLC）对药材进行定性鉴别；采用高效液相色谱法测定药材中表儿茶素、2α，3α-epoxy-5，7，3′，4′-tetra-hydroxy-flavan-（4β→8）-epicatechin（成分A）的含量：色谱柱为Comatex TM C18，流动相为乙腈-水（梯度洗脱），流速为1.0 ml/min，检测波长为210 nm，柱温为30℃，进样量为5 μl。结果：药材性状和粉末显微鉴别图谱清晰。血人参的TLC图斑点清晰，分离良好。表儿茶素、成分A检测进样量线性范围分别为0.274 5～4.392 0 μg（r=0.999 6）、0.103 0～1.648 3 μg（r=0.999 4）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜3%；加样回收率分别为99.76%～104.82%（RSD=2.42%，n=6）、97.98%～104.99%（RSD=2.75%，n=6）。结论：该研究所建标准可用于血人参的质量控制。

血人参；生药学鉴别法；薄层色谱法；高效液相色谱法；含量测定

血人参是豆科蝶形花亚科植物茸毛木蓝Indigofera stachyoides Lindl.的根，为贵州省苗族用药，收载于2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》，别名为山红花、铁刷子、红苦刺。血人参主要分布在云南、贵州、四川、广西等地，尤其在贵州贵阳、安顺、黔东南、黔西南等地有较为广泛的分布。血人参性温，味微苦涩，有补气摄血、滋阴补肾之功效，主治崩漏、跌打、风湿、肝硬化、痢疾及疳积等［1-3］。在对其化学成分及生物活性研究中，本课题组发现了有一定抗肝细胞损伤活性的2α，3α-epoxy-5，7，3′，4′-tetra-hydroxy-flavan-（4β→8）-epicatechin（成分A）以及可以辅助放疗化疗的化合物表儿茶素［4-7］。迄今为止，对于血人参药材鉴别方法的相关研究文献极少，因此笔者对血人参药材进行性状和显微特征鉴别，采用薄层色谱法（TLC）对其进行定性鉴别，采用高效液相色谱法（HPLC）测定药材中表儿茶素和成分A的含量，以期为该药材的后续质量控制和研发提供参考。

1　材料

1.1仪器

DFT-200型粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；YS-100型双目生物显微镜（日本Nikon公司）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；B-490型旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）；AE240型1/10万电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；ZF-2型三用紫外分析仪（上海安亭电子仪器厂）；1100型HPLC仪（美国Agilent公司）；AY-120型电子分析天平（日本Shimadzu公司）；硅胶GF254薄层板（美国Merk公司）。

1.2试剂

表儿茶素对照品（贵州省食品药品检验所，批号：800-2000014，纯度：98%）；成分A对照品（笔者自制，以氢谱、碳谱确定结构，HPLC测定纯度为98%）；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3药材

血人参（见表1）经贵阳中医学院陈德媛研究员鉴定为真品。

2　方法与结果

2.1性状鉴别

血人参根头部形大而不规则，表面粗糙；下部较细长，表面有细微的纵皱纹；全体均有皮孔，外皮呈灰棕色，去皮后内显灰紫色。质坚硬，断面淡黄色，纤维性，稍有香气，详见图1。

2.2显微鉴别[8]

药材粉末在显微镜下可见：①棕色块多见，形状大小不规则；②草酸钙方晶极易察见；③泌细胞呈长管道状，充满黄色分泌物；④导管以网纹及梯纹为主；⑤淀粉粒类球或长圆形，脐点点状，复粒2～8粒；⑥纤维分布较多，棕黄色，单个存在或集合成束，有时亦与方晶结合成晶鞘纤维，晶纤维常成束；⑦木纤维较细长，壁较薄，纹孔稀疏点状；韧皮纤维纺锤或梭形，壁厚；⑧木栓细胞呈淡黄色或棕黄色，细胞壁略微增厚，形状不规则；⑨石细胞偶见。血人参粉末显微特征见图2。

表1　血人参来源Tab 1　Origin of I.stachyoides

图1　血人参药材Fig 1　I.stachyoides

图2　血人参粉末显微特征1.棕色块；2.草酸钙方晶；3.树脂道；4.导管；5.淀粉粒；6.纤维；7.晶纤维束；8.晶鞘纤维；9.木纤维；10.韧皮纤维；11.木栓细胞；12.石细胞Fig 2　Microscopic characteristics of I.stachyoides powder 1.brown block；2.calcium oxalate crystal；3.resin canal；4.catheter；5. starch grain；6.fiber；7.crystal fiber bundle；8.crystal sheath fiber；9.wood fiber；10.bast fiber；11.cork cell；12.stone cell

2.3TLC鉴别[9-10]

取样品粉末5.0 g（过40目筛），精密称定，加30倍量80%甲醇于圆底烧瓶中回流提取1 h，静置放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10 ml使溶解，作为供试品溶液。另分别精密称定表儿茶素和成分A对照品适量，加80%甲醇制成表儿茶素、成分A质量浓度均为1 mg/ml的单一对照品溶液和混合对照品溶液。按TLC法［2015年版《中国药典》（四部）］［11］试验，吸取上述供试品溶液2 μl、单一对照品溶液和混合对照品溶液各4 μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿-甲醇-甲酸（30∶10∶1，V/V/V）为展开剂，置于氨蒸气饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇，于105℃加热至斑点显色清晰，置日光灯下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，详见图3。

图3　薄层色谱图1.六枝产血人参；2.普安产血人参；3.成分A对照品；4.混合对照品；5.表儿茶素对照品；6.花溪产血人参Fig 3　TLC chromatograms1.I.stachyoides in Liuzhi；2.I.stachyoides in Puan；3.reference substance of reference A；4.mixed references；5.reference substance of epicatechin；6.I.stachyoides in Huaxi

2.4含量测定[12-13]

2.4.1色谱条件色谱柱：ComatexTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（洗脱程序见表2）；流速：1.0 ml/min；检测波长：210 nm；柱温：30℃；进样量：5 μl。色谱见图4。

表2　梯度脱程序Tab 2　Gradient elution program

图4　样品和对照品高效液相色谱比较图1.表儿茶素；2.对照品AFig 4　Comparison of chromatograms of sample and reference substance1.epicatechin；2.referenceA

2.4.2混合对照品溶液的制备分别取表儿茶素对照品、成分A对照品适量，精密称定，置于同一10 ml量瓶中，用5%乙腈溶液溶解并定容，摇匀，即得表儿茶素、成分A质量浓度分别为0.171 7、0.457 5 mg/ml的混合对照品溶液。

2.4.3供试品溶液的制备称取样品5 g，粉碎成粗粉，过40目筛，用80%甲醇125 ml回流提取2 h，冷却，以80%甲醇补足质量，滤过，浓缩得浓稠浸膏。上述浓稠浸膏用适量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得的乙酸乙酯部分用5%乙腈溶液稀释至25 ml，用0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。

2.4.4线性关系考察分别精密量取“2.4.2”项下混合对照品溶液0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 μl，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以表儿茶素、成分A进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得表儿茶素、成分A回归方程分别为y=7 753.1x+547.65（r=0.999 6）、y=11 552x+ 403.02（r=0.999 4）。结果表明，表儿茶素、成分A检测进样量线性范围分别为0.274 5～4.392 0、0.103 0～1.648 3 μg。

2.4.5精密度试验取“2.4.2”项下对照品溶液适量，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，表儿茶素、成分A峰面积的RSD分别为2.57%、1.77%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.6稳定性试验取“2.4.3”项下供试品溶液（批号：HIS20101023）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、10、12 h时按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，表儿茶素、成分A峰面积的RSD分别为2.78%、2.25%（n=6），表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.4.7重复性试验精密称取同一批样品（批号：HIS20101023）适量，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，表儿茶素、成分A峰面积的RSD分别为1.63%、2.70%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.4.8加样回收率试验取已知含量样品适量，共6份，分别加入一定质量的表儿茶素、成分A，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

表3　加样回收率试验结果（n=6）Tab 3　Results of recovery tests（n=6）

3　讨论

笔者分别考察了80%甲醇回流提取不同时间（设为2、4、6、8 h）和超声提取不同时间（设为15、30、45、60 min）的方法，通过外标法分别计算并比较表儿茶素和成分A的含量，结果表明，以80%甲醇回流2 h时提取效率较高。

本研究表明，血人参药材的性状、粉末显微鉴别、TLC鉴别可作为苗药血人参的专属性定性鉴别依据，可较好地排除混淆品种；同时，本研究建立的血人参中表儿茶素和成分A含量测定方法简单可行，结果准确可靠。综上，本研究所建标准可用于苗药血人参的质量控制。

表4　样品含量测定结果（n=3，mg/g）Tab 4　Results of contents determination of samples（n=3，mg/g）

［1］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草：第四卷［M］.上海：上海科学技术出版社，1999：3 233-3 234.

［2］江苏新医学院.中药大辞典：下［M］.上海：上海科学技术出版社，2001：2 085-2 089.

［3］贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准［M］.贵阳：贵州科技出版社，2003：176.

［4］裘璐，梁妍，唐贵华，等.茸毛木蓝根的化学成分研究［J］.中成药，2013，35（2）：320.

［5］Qiu L，Liang Y，Tang GH，et al.Two new flavonols including one flavan dimer from the roots of Indigofera stachyodes［J］.Phytochemistry Letters，2013，6（3）：368.

［6］Li YY，Li CQ，Xu QT，et al.Antioxidant，α-glucosidase inhibitory activities in vitro and alloxan-induced diabetic rats'protective effect of Indigofera stachyodes Lindl.root［J］.J Med Plants Res，2011，5（14）：3 321.

［7］裘璐.苗药血人参化学成分及其质量控制研究［D］.贵阳：贵阳医学院，2013.

［8］罗晓霞.草果与拟草果的性状与显微鉴别［J］.中草药，2014，37（2）：227.

［9］胡曙晨，马雪红，李新霞，等.肉桂子药材的薄层鉴别方法研究［J］.中药及天然药物，2014，29（2）：111.

［10］张学兰，徐苹，李慧芬.焦栀子的薄层鉴别与有效成分含量控制方法研究［J］.辽宁中医杂志，2011，38（2）：335.

［11］国家药典委员会.中华人民共和国药典：四部［S］.2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：57.

［12］赫军，马秉智，梁莹莹，等.HPLC法测定藤梨根中表儿茶素的含量［J］.中国药房，2016，27（3）：378.

［13］李如标，王梅娟.高效液相色谱法测定复方醋酸地塞米松搽剂中2组分的含量［J］.中国新药与临床杂志，2011，30（8）：623.

（编辑：张静）

Study on the Quality Standard of Miao Medicine Indigofera stachyoides

ZHU Xinyu，LUO Hanchao，HE Maoqiu，HU Zhaoyang，LIANG Yan，HAO Xiaoyan（School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard for Mian medicine Indigofera stachyoides.METHODS：Medicinal properties and microscopic characteristics were identified；TLC was used for the qualitative identification；HPLC was conducted for content determination of epicatechin and 2α，3α-epoxy-5，7，3′，4′-tetra-hydroxy-flavan-（4β→8）-epicatechin（reference A）：the column was Comatex TM C18with mobile phase of acetonitrile-water at a flow rate of 1.0 ml/min，and detection wavelength was 210 nm，column temperature was 30℃，injection volume was 5 μl.RESULTS：It showed clear microscopic identification map.I. stachyoides TLC had clear spots and well separated.The linear range was 0.274 5-4.392 0 μg（r=0.999 6）for epicatechin，and 0.103 0-1.648 3 μg for reference A（r=0.999 4），RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3%，recoveries were 99.76%-104.82%（RSD=2.42%，n=6）and 97.98%-104.99%（RSD=2.75%，n=6）respectively.CONCLUSIONS：The established standard can be used for the quality control of I.stachyoides.

Indigofera stachyoides；Pharmacognostic identification；TLC；HPLC；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）27-3829-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.28

国家自然科学基金资助项目（No.81460640）；贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目（No.黔科合ZY字〔2013〕3006号）

＊硕士研究生。研究方向：天然药物化学。E-mail：zxycs2009@ 126.com

教授。研究方向：天然产物成分分析、质量标准。E-mail：haoxiaoyan@vip.163.com

（2016-04-06

2016-05-15）