基于ZnO/石墨烯复合材料的有机磷电化学生物传感器研究

孙墨杰，王世杰

(东北电力大学 化学工程学院，吉林 吉林 132012)



基于ZnO/石墨烯复合材料的有机磷电化学生物传感器研究

孙墨杰，王世杰

(东北电力大学 化学工程学院，吉林 吉林 132012)

火力发电厂电力设备运行时，为减缓电力设备的结垢腐蚀，需要在循环冷却水中添加一定量有机磷系缓蚀阻垢剂，及时检测有机磷在循环冷却水中的含量对保证系统正常运行至关重要。现有检测方法操作繁琐，过程复杂。为实现快速检测，研究组装AChE-ZnO/石墨烯-GCE电化学生物传感器，间接检测有机磷含量。结果表明，AChE-ZnO/石墨烯-GCE电化学生物传感器用于检测有机磷，具有良好的电化学响应。根据有机磷浓度与抑制率之间的关系以及氧化电流减小的程度，可计算出有机磷的浓度，以达到检测其含量的目的。

有机磷；石墨烯；电化学生物传感器

循环冷却水是工业用水中的一种常见用水，在火力发电厂中作为循环冷却介质通过冷却塔，其使用量高达火力发电厂总用水量的80%以上。循环冷却水在设备运行时的水质优良与否直接影响系统的运行状况。为了减缓电力设备的结垢腐蚀，需在循环冷却水中添加一定量的缓蚀阻垢剂[1]，通常加入有机磷系缓蚀阻垢剂[2-3]。因此，快速检测循环冷却水中有机磷系缓蚀阻垢剂的含量对电力系统的正常运行而言意义重大。

目前，应用于检测循环冷却水中有机磷酸缓蚀阻垢剂含量的方法多种多样。如国标(GB6913.13-86)采用的钼蓝比色法[4]，该方法具有标准曲线线性好、准确度和精密度较高的优点，但是当系统中有机物较多时，样品灼烧分解时极易碳化，造成分析误差较大；离子色谱检测法[5]，该方法具有灵敏、抗干扰能力强等优点，研究证明以总磷浓度反映循环水中的有机磷(如HEDP)的浓度，存在很大缺陷；磷钒钼黄比色法[6]，研究表明该方法用于循环冷却水中磷系缓蚀阻垢剂的测定较为理想，具有良好的选择性和重现性；此外，还有UV(紫外)-光氧化法[7]，微波消解-分光光度法[8]等。以上方法虽然可以准确测量循环水中的有机磷含量，也可以确保稳定性和重现性，但均需专用的大型仪器设备，且检测时需要对水样做复杂的预处理，操作步骤繁琐且对操作人员素质要求较为严格，无法实现现场的快速检测。

针对传统缓蚀阻垢剂检测方法中存在的不足，拟采取一种全新的、高效的检测方法。近十年来，电化学生物传感器的研究工作取得了巨大进步，尤其是基于ZnO/石墨烯复合材料的电化学生物传感器。结合国内外相关研究，关于有机磷检测和ZnO/石墨烯复合材料制备的报道层出不穷[9-13]，但将基于ZnO/石墨烯复合材料的电化学生物传感器应用于检测循环冷却水中有机磷含量的研究尚未见报道。

研究采用水热法合成ZnO/石墨烯复合材料，并自组装基于该复合材料的电化学生物传感器，用于检测循环冷却水中缓蚀阻垢剂的含量。并考察不同抑制时间和不同底物浓度两种因素对该传感器用于检测有机磷含量的影响。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

试剂：天然鳞片石墨(325目)，浓硫酸(分析纯)，高锰酸钾(分析纯)，硝酸钠(分析纯)，30%双氧水(分析纯)，5% HCl(分析纯)，乙二醇(分析纯)，醋酸锌(分析纯)，氢氧化钠(分析纯)，Al2O3抛光粉(0.3 μm，0.05 μm)，无水乙醇(分析纯)，氯化钾(分析纯)，K3Fe(CN)6(分析纯)，Nafion(5%)，乙酰胆碱酯酶(220 u/mg)，戊二醛(分析纯)，羟基乙叉二磷酸(98.0%)，氯化乙酰胆碱(99.0%)。

仪器：高压反应釜，GL-21MC高速冷冻离心机，GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱，KQ-100超声波清洗器，FA2204A电子天平，DF-101S集热式磁力加热搅拌器，CHI-760e电化学工作站，SHZ-D循环水式真空泵，JEOL-LV6500扫描电子显微镜(SEM)，XRD衍射仪，DZF-6090真空干燥箱，GNA-300氮、空气发生器，BTF-1200C-Ⅱ-PECVD。

1.2 材料的制备

1.2.1 氧化石墨的制备

实验采用Hummers方法制备氧化石墨。具体过程为：将浓硫酸(23 mL)在冰水浴条件下加入到250 mL反应瓶中，向其中加入石墨粉(1 g)和硝酸钠(0.5 g)，搅拌均匀后，再向混合物中加入高锰酸钾(3 g)，并控制反应温度不超过20 ℃。搅拌2 h后升温到35 ℃，继续搅拌30 min后加入去离子水(46 mL)，同时将反应温度升高到98 ℃，持续加热20 min。向反应瓶中加入双氧水(30%)至溶液呈亮黄色为止，趁热过滤，用HCl溶液(5%)和去离子水洗涤，充分干燥后保存备用。

1.2.2 ZnO/石墨烯复合材料的制备

实验采用水热法合成ZnO/石墨烯复合材料。具体过程为：称取15 mg氧化石墨溶于100 mL乙二醇中，进行超声处理使其完全分散并剥离成氧化石墨烯。再称取100 mg醋酸锌和15 mg氢氧化钠溶于100 mL乙二醇溶液中，磁力搅拌至完全溶解。将两种溶液混合均匀，转移到高压反应釜中，在160 ℃下加热反应24 h后，将生成的产物进行离心、洗涤、干燥，即得ZnO/石墨烯纳米复合物。

1.3 材料的表征

材料的结晶度通过XRD衍射仪进行表征，考察材料结晶度以及晶型发育情况；利用日本电子JEOL-LV6500扫描电子显微镜(SEM)对材料表面形貌进行表征，考察石墨烯剥层程度、氧化锌纳米颗粒粒径以及氧化锌纳米颗粒在石墨烯表面分布情况。

1.4 电化学生物传感器的制备

1.4.1 玻碳电极的预处理

首先将玻碳电极(GCE)分别用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3抛光粉在麂皮上打磨抛光，然后在去离子水和无水乙醇中依次超声1 min-2 min，将电极表面残留的抛光粉除去，再用N2将电极吹干。以打磨抛光后的GCE作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂电极作为对电极在含有0.5 mol/L KCl的1 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中进行循环伏安扫描测试来鉴定GCE是否打磨合格。扫描范围为-0.1 V-0.6 V，当氧化还原峰电位差小于85 mV时，GCE方可用于电极修饰，否则，须重复上述抛光过程，直到合格为止。

1.4.2 ZnO/石墨烯修饰电极的制备

首先取5 μL 0.5%的Nafion溶于1 mL无水乙醇中，再加入适量ZnO/石墨烯复合材料，超声分散后，取5 μL该分散液滴涂于打磨合格的GCE表面，室温下空气中晾干，干燥后即得ZnO/石墨烯修饰电极。

1.4.3 乙酰胆碱酯酶(AChE)-ZnO/石墨烯修饰电极的制备

将100 mU 的乙酰胆碱酯酶(AChE)(5 μL)和2.5% 戊二醛(1 μL)混合液滴加在ZnO/石墨烯修饰电极上，于冰箱中干燥后即得乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器(AChE-ZnO/石墨烯-GCE)。

1.5 电化学性能测试

利用上海辰华CHI-760e电化学工作站测试ZnO/石墨烯复合材料用于检测有机磷(HEDP)含量的性能，实验采用传统三电极体系，分别将裸玻碳电极(GCE)、AChE修饰玻碳电极(AChE-GCE)、AChE-ZnO/石墨烯-GCE置于100 mL 含0.1 mmol/L氯化乙酰胆碱(ATCl)的pH7.5 PBS底液中，进行循环伏安扫描，扫描范围为0.0 V-1.0 V，扫描速率为50 mv·s-1。并考察不同抑制时间和不同HEDP浓度两种因素对检测结果的影响。

2 结果与讨论

2.1 材料的表征

2.1.1材料的XRD表征

由图1所示的氧化石墨XRD谱图，谱图中2θ=10.8°和2θ=44°处为氧化石墨的特征衍射峰，2θ=26.5°处为天然石墨的特征衍射峰。从图中可以看出，产物中氧化石墨的特征衍射峰强度很大，而天然石墨的特征衍射峰强度则很弱，说明天然石墨在氧化过程中由于含氧官能团的引入，使得石墨层间距离大幅度提升，产物的氧化程度很高，氧化石墨片层剥离程度较高。

图1 氧化石墨XRD谱图图2 水热法合成的ZnO/石墨烯复合材料XRD谱图

由图2所示的ZnO/石墨烯复合材料的XRD谱图，从图中可以看出，ZnO纳米颗粒的每个特征衍射峰都具有较高的强度，表明ZnO晶体的晶型发育良好，结晶度较高；2θ=26.5°处的衍射峰归属于多层石墨烯，由于石墨烯经超声剥离到一定厚度后其XRD衍射峰会减弱或消失[14-15]。因此，石墨烯的衍射峰强度较弱，以致于在谱图中看不到石墨烯的特征衍射峰。

2.1.2 材料的SEM表征

图3 ZnO/石墨烯复合材料的SEM图

a：裸玻碳电极(GCE)；b：AChE修饰玻碳电极(AChE-GCE)；c：AChE-ZnO/石墨烯-GCE图4 不同电极在100mL 含0.1 mmol/L ATCl的pH7.5 PBS底液中的循环伏安曲线

由图3可以看出，ZnO晶体呈颗粒状，显示出良好的规则性和均匀的分散性，单个晶体颗粒直径约为70 nm。石墨烯上的ZnO晶体生长状态良好，这将有利于提高电化学检测的灵敏性。

2.2 电化学检测有机磷(HEDP)

2.2.1 ATCl在不同电极表面的电化学行为

为了验证ZnO/石墨烯复合材料用于检测有机磷(HEDP)含量的性能，实验分别将裸玻碳电极(GCE)、AChE修饰玻碳电极(AChE-GCE)、AChE-ZnO/石墨烯-GCE置于100 mL 含0.1 mmol/L ATCl的pH7.5 PBS底液中，进行循环伏安扫描，扫描范围为0.0 V-1.0 V，扫描速率为50 mV·s-1(如图4)。

由图4可以看出，ATCl在裸GCE表面的响应电流极弱，在GCE表面修饰上适量的AChE后，出现明显的氧化峰电流，证明AChE对ATCl具有一定的催化活性，但此处的氧化峰电流仍较弱。而在GCE表面修饰AChE-ZnO/石墨烯后，氧化峰电流明显增强。这归因于石墨烯较大的比表面积和良好的导电性能，以及ZnO和石墨烯的协同效应。石墨烯非凡的电子传递性，改善了电极的导电性，加快了电极上电子的传递速度，均匀分散的ZnO纳米颗粒的存在又能使石墨烯分散性得到极大提高，且ZnO具有良好的生物相容性，可以保证AChE的活性不受不良影响。

2.2.2 抑制时间的影响

由于在有机磷(HEDP)检测分析中，抑制时间是最有影响力的参数之一，为了在后续检测中得到最优的抑制时间，实验首先将AChE-ZnO/石墨烯-GCE电化学生物传感器在0.07 mol/L的HEDP溶液中分别抑制2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min、14 min，将抑制后的传感器置于100 mL含有0.1 mmol/L氯化乙酰胆碱(ATCl)的pH7.5 PBS缓冲溶液中，进行循环伏安扫描(CV，如图5)。扫描范围为0.0 V-1.0 V，扫描速率为50 mV·s-1。并根据循环伏安扫描结果，计算出不同抑制时间下对应的抑制率(如图6)。

图5 A和B为AChE-ZnO/石墨烯-GCE在0.07 mol/L有机磷(HEDP)溶液中抑制不同时间后，在pH为7.5的0.1 mmol/L氯化乙酰胆碱(ATCl)底液中的循环伏安曲线

图6 HEDP对AChE的抑制率与抑制时间的关系

图5和图6显示了抑制时间对电化学生物传感器的影响。显然，随着在有机磷(HEDP)溶液中抑制时间的增加，ATCl在传感器上的响应电流逐渐减小。当抑制时间大于8 min，响应电流值趋向一个稳定值，表明HEDP和AChE之间的结合位点达到平衡，导致AChE对ATCl的催化活性受到最大程度的抑制。因此，最佳抑制时间选定为8 min，从而使抑制率最大。

2.2.3 不同HEDP浓度的影响

为了考察HEDP浓度变化的影响，实验将AChE-ZnO/石墨烯-GCE分别在浓度为0.02 mol/L、0.04 mol/L、0.06 mol/L、0.08 mol/L、0.10 mol/L的HEDP溶液中抑制8 min，并在抑制前后于100 mL含有0.1 mmol/L(ATCl)的pH 7.5 PBS缓冲溶液中，进行循环伏安扫描(CV)，扫描范围为0.0 V-1.0 V，扫描速率为50 mV·s-1(如图7)。并根据循环伏安扫描结果，计算出不同HEDP浓度下对应的抑制率(如图8)。

由图7和图8可以看出，HEDP浓度越大，其对AChE-ZnO/石墨烯-GCE的抑制越强，氧化峰电流减小的越明显。且在0.02 mol/L-0.10 mol/L范围内，HEDP浓度与抑制率间呈良好的线性关系。根据该结果，在检测未知浓度的HEDP时，可以根据其浓度与抑制率之间的线性关系以及氧化电流减小的程度，计算出HEDP的浓度，以达到检测HEDP含量的目的。

此外，如图7E所示，抑制后的氧化峰电流极其微弱，这表明修饰了100 mU AChE的AChE-ZnO/石墨烯-GCE电化学生物传感器，在条件为100 mL含有0.1 mmol/L ATCl的pH 7.5 PBS缓冲溶液中进行检测的条件下，对HEDP的检测上限为0.10 mol/L。

图7 不同有机磷(HEDP)浓度抑制电化学生物传感器前后对ATCl的循环伏安曲线A-E 图中HEDP浓度分别为0.02mol/L、0.04mol/L、0.06mol/L、0.08mol/L、0.10mol/L

图8 HEDP浓度与抑制率的关系

3 结 论

(1)借助于石墨烯较大的比表面积和良好的导电性能，以及ZnO和石墨烯的协同效应，AChE-ZnO/石墨烯与GCE组装的电化学生物传感器，对ATCl具有良好的电化学响应，氧化峰电流明显，可用于间接检测HEDP含量。

(2)AChE-ZnO/石墨烯-GCE电化学生物传感器用于检测HEDP时，最佳抑制时间为8 min。随着HEDP浓度的增加，AChE-ZnO/石墨烯-GCE受到的抑制程度越高，氧化电流减小的越明显。

(3)修饰了100 mU AChE的AChE-ZnO/石墨烯-GCE电化学生物传感器，在条件为100 mL含有0.1 mmol/L ATCl的pH7.5 PBS缓冲溶液中进行检测的条件下，对HEDP的检测上限为0.10 mol/L。在检测未知浓度的有机磷时，可以根据其浓度与抑制率之间的关系以及氧化电流减小的程度，计算出HEDP的浓度，以达到检测的目的。

[1] 张万友，沈兴磊，周立文，等.米糠浸提液作为铜缓蚀剂的研究[J].东北电力大学学报，2013，33(3)：64-68.

[2] 唐俊，徐章法，徐伯兴，等.循环冷却水系统缓蚀剂的现状及绿色化进展[J].工业水处理，2004，24(6):1-5.

[3] 胡玉国.水处理缓蚀剂应用现状及发展方向[J].化工科技市场，2000，23(4):5-7.

[4] GB6913.2-1986.UDC628.175:621.187.1:543.06[S].

[5] 马剑，袁东星，官斌，等.离子色谱法测定循环冷却水中的羟基-1，1-亚乙基二磷酸[J].色谱，2007，25(2):245-247.

[6] 瞿莜蔷，唐国平.磷钒钼黄比色法测定循环水中磷酸盐的探讨[J].大氮肥，2001，24(5):51-354.

[7] 孙墨杰，靳世久，腾飞，等.循环冷却水膦系缓蚀阻垢剂在线分析的研究[J].化工自动化及仪表，2002，29(4):70-73.

[8] 杨迎军，关晓辉，秦玉华，等.微波消解-分光光度法快速测定水中总磷[J].东北电力大学学报，2007，27(4)，40-41.

[9] Pranati N，Anbarasan B，Ramaprabhu S.Fabrication of Organophosphorus Biosensor Using ZnO Nanoparticle-Decorated Carbon Nanotube-Graphene Hybrid Composite Prepared by a Novel Green Technique[J].Phys Chem C，2013，117(25):13202-13209.

[10] Xu M R，Zhu J Y，Su H C，et al.Electrochemical determination of methyl parathion using poly(malachite green)/graphene nanosheets-nafion composite film-modified glassy carbon electrode[J].J Appl Electrochem，2012，42(7):509-516.

[11] Sun X，Gong Z L，Cao Y Y，et al.Acetylcholinesterase Biosensor Based on Poly(diallyldimethylammonium chloride)-multi-walled Carbon Nanotubes-graphene Hybrid Film[J].NANO-MICRO，2013，5(1):47-56.

[12] Liu T，Xu M R，Yin H S，et al.A glassy carbon electrode modified with graphene and tyrosinase immobilized on platinum nanoparticles for sensing organophosphorus pesticides[J].Microchim Acta，2011，175(8):129-135.

[13] 景雁凤，刘志敏，赵振江，等.基于石墨烯-氧化锌复合物的乙酰胆碱酯酶生物传感器用于辛硫磷的测定[J].河南工业大学学报，2013，34(2):72-76.

[14] Xu C，Wang X，Zhu J.Graphene-metal particle nanocomposites[J].J Phys Chem，2008，112(50):19841-19845.

[15] Cai D，Song M.Preparation of fully exfoliated graphite oxide nanoplatelets in organic solvents[J].J Mater Chem，2007，17(35):3678-3680.

Research on Electrochemical Biosensor Detection of Organophosphorus Based on ZnO/Graphene Composites

SUN Mo-jie，WANG Shi-jie

(School of Chemical Engineering，Northeast Dianli University，Jinlin Jilin 132012)

In order to reduce the scale and corrosion of power equipment，it is necessary to add a certain amount of scale inhibitors of organophosphorus in circulating cooling water system.So it is critical to detect the content of organophosphorus rapidly to ensure the normal operation of the system.While up to now，the organophosphorus detection methods are complicated.Owing to the advantages of rapid detection and simple operation，electrochemical biosensor based on AChE-ZnO/graphene-GCE is applied to detect organophosphorus.The results show that it has a good electrochemical response for AChE-ZnO/graphene-GCE to detect organophosphorus.According to the relation between concentration of organophosphorus and the inhibition rate，and the degree of the oxidation current decreasing，it can calculate the concentration of organophosphorus and achieve the intention of the testing organophosphorus content.

Organophosphorus；Graphene；Electrochemical biosensor

2016-04-12

吉林省科技发展计划项目(20130206002SF)

孙墨杰(1967-)，男，吉林省吉林市人，东北电力大学化学工程学院教授，博士，主要研究方向：电力系统化学监测及水处理工程技术.

1005-2992(2016)05-0057-06

O646

A