菜豆中两种重要检疫性细菌检测方法

杨柳 张 一 王磊

摘要：对菜豆中两种重要检疫性细菌——菜豆萎蔫病菌和菜豆晕疫病菌检测方法进行研究。比较菜豆萎蔫病菌和菜豆晕疫病菌的检测方法，结果表明：环介导等温扩增方法应用于菜豆检疫性细菌检测，可实现快速现场检测，且特异性强，灵敏度高。对保障国家农业生产安全、保护我国农村菜豆种质资源的安全起到重要作用。

关键词：菜豆萎蔫病菌；菜豆晕疫病菌；检测；温扩增技术

基金项目：吉林工商学院基金项目（院理科合字〔2015〕第006号）

中图分类号： S435.24 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.08.058

菜豆又名四季豆、芸豆、饭豆，为豆科、碟形花亚科、菜豆族、菜豆属的普通种[1]。

中国是菜豆的主要生产国，也是主要出口国，特别是随着国家种植业结构的调整，菜豆生产已成为产区农民增收的重要途径之一[2]。普通细菌性疫病是影响全世界菜豆生产的主要病害之一，一般可导致20%～60%的产量损失，严重时产量损失率高达80%[3]。本文针对菜豆中菜豆萎蔫病菌和菜豆晕疫病菌两种检疫性细菌的检测方法进行研究，旨在为菜豆种质资源的安全起到一定作用。

1 菜豆中两种重要检疫性细菌传统检测技术

目前许多国家针对菜豆萎蔫病菌和菜豆晕疫病菌常用的鉴定检测方法包括选择培养基分离检测法、血清学测定、免疫荧光菌落染色法、PCR技术等[3]。

1.1 选择培养基分离检测法

赵友福等[4]对菜豆萎蔫病菌的种子检验鉴定技术进行了研究，发现523，NBY+ TTC和NBY+刚果红三种培养基均可作为分离培养基，对带菌种子分离的灵敏度为1.8×102cuf/m1。

1.2 血清学测定法

赵友福等[5]对菜豆萎蔫病菌的血清检测鉴定技术进行了研究，通过对19个Cff菌株和其他6个属14个种的植物病原细菌20个菌株的测定，结果发现约50%的Cff菌株为强阳性反应。血清学检测灵敏度为4.5×104 cfu/ml。

1.3 免疫荧光菌落染色法

高泉准[6] 研究了菜豆萎蔫病免疫荧光菌落染色法快速诊断技术，灵敏度高达1.23×107cuf/m1，且可分离出括的菌株。

1.4 PCR检测法

张晓梅等[7]研究了菜豆萎蔫病菌的PCR检测技术，该检测方法特异性强、灵敏度高，在100pg的基因组浓度下仍能检测到很强的条带。

1.5 传统检测技术的缺点

在上述检测方法中，选择培养基分离检测法检测周期较好，而且检测步骤较繁琐。血清学检测技术虽然效果好，检测过程易操作，但是检测目标单一。免疫荧光菌落染色法检测周期长、反应灵敏度低。PCR检测法虽然特异性较强，灵敏度较高，但是测量时使用的设备较昂贵，需要专业人员在实验室完成，操作过程较繁琐，不适合于在基层进行现场检测。因此，急需开发特异性强、检测灵敏度高、操作简单、成本低、适用于基层现场快速检测的方法。

2菜豆中两种重要检疫性细菌LAMP检测新技术

2.1 LAMP技术简介

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是在65℃恒温条件下进行核酸快速扩增，利用两条特异性内引物和两条特异性外引物识别靶基因上的六个区域，其DNA聚合酶具有链置换活性，几十分钟即可完成核酸扩增。

2.2 LAMP技术用于菜豆中两种重要检疫性细菌检测的优势

2.2.1 可实现基层现场实时检测 利用LAMP技术开发菜豆萎蔫病菌和菜豆晕疫病菌检测方法及配套试剂盒，只需对检测菜豆萎蔫病菌和菜豆晕疫病菌进行简单的DNA提取，就可以完成直接的扩增和检测。检测过程只需配一台普通的水浴锅，就可以在基层进行现场实时检测，特别适用于农村及偏远山区等进行菜豆萎蔫病菌和菜豆晕疫病菌检测。

2.2.2 检测灵敏度高 与常规PCR检测方法相比，LAMP检测灵敏度通常是常规PCR的10～100倍。

2.2.3 检测速度快 利用LAMP技术检测菜豆萎蔫病菌和菜豆晕疫病菌，基本反应时间可以控制在60～90分钟内。如果实验过程中加入环引物，反应时间可以缩短到30～45分钟。

2.2.4 特异性强 利用LAMP方法进行菜豆萎蔫病菌和菜豆晕疫病菌检测，需要在Genebank 上找到菜豆萎蔫病菌、菜豆晕疫病菌的保守序列，采用在线LAMP引物设计软件分别设计5组特异引物。与靶序列上的6个特异性部位进行准确结合发生扩增反应。与常规PCR检测方法相比，特异性更强。

2.2.5 可实现视化检测 利用LAMP方法进行菜豆萎蔫病菌和菜豆晕疫病菌检测，在检测体系中可加入荧光染料——钙黄绿素，实验的结果产生绿色荧光，可以通过肉眼直接判断。

3 结论

LAMP检测技术非常适用于进行菜豆中两种重要检疫性细菌的检测。LAMP技术的应用必将推动基层、农村、偏远地区菜豆中重要检疫性细菌的检测向着更低廉、更方便、更准确的方向发展。

参考文献

[1]冯国军，徐启江，李玉花，等.普通菜豆SSR反应条件的优化[J].东北农业大学学报，2014，38（01）：27-34.

[2]冯佰利，鱼欢，高小丽，等.中国芸豆品牌发展战略研究[J].中国农学通报，2005，21（16）：454-457.

[3]徐新新.菜豆普通细菌性疫病菌原学研究及抗病种质资源鉴定[D].北京：中国农业科学院，2012.

[4]赵友福，高泉准，陈红燕，等.菜豆萎蔫病菌的种子检验鉴定技术研究[J].植物检疫，1997，11（03）：129-133.

[5]赵友福，陈红燕，张乐，等.菜豆萎蔫病菌的血清检测鉴定技术研究[J].植物检疫，1997，11（04）：193-198.

[6]高泉准.菜豆萎蔫病免疫荧光菌落染色法快速诊断技术研究[A].中国植物病理学会第六届代表大会暨学术年会论文集[C].北京：中国病理学会.1998：629-631.

[7]张晓梅，林友伟，吴新华，等.菜豆萎蔫病的PCR检测技术[J].南京农业大学学报，2004，27（03）：42-45.