2型糖尿病患者糖原合成酶激酶3β的表达及活性

谭 婕，吴建华，王江平，邹俊清，明安萍

(1.湖北中医药大学附属湖北省中医院检验科，武汉 430061；2.湖北省中医院检验科，武汉 430061)



·论 著·

2型糖尿病患者糖原合成酶激酶3β的表达及活性

谭 婕1，吴建华2△，王江平2，邹俊清2，明安萍2

(1.湖北中医药大学附属湖北省中医院检验科，武汉 430061；2.湖北省中医院检验科，武汉 430061)

目的 探讨糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)在2型糖尿病患者和健康者外周血单个核细胞中的蛋白表达及活性水平。方法 运用酶联免疫吸附法(ELISA)检测30例2型糖尿病血糖未控制患者(实验1组)、30例2型糖尿病血糖控制患者(实验2组)和30例健康者(健康对照组)外周血单个有核细胞GSK-3β蛋白表达及活性水平，并分析其结果。结果 2型糖尿病患者GSK-3β蛋白水平比健康对照组升高(P<0.05),实验1组GSK-3β活性水平比健康对照组和实验2组升高(P<0.05)；实验2组GSK-3β蛋白水平比健康对照组升高(P<0.05)。实验1组男性GSK-3β活性水平比健康对照组男性升高(P<0.05)。结论 2型糖尿病患者GSK-3β蛋白高表达。经药物治疗后血糖控制者GSK-3β蛋白仍高表达，但活性水平明显下降。2型糖尿病血糖未控制男性患者GSK-3β活性水平明显增高。

2型糖尿病； 外周血单个核细胞； 糖原合成酶激酶3β

糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是一种遗传保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，可调控基因转录、细胞周期代谢、细胞凋亡、肿瘤发生等[1-3]。目前已知GSK-3β是细胞内胰岛素、生长因子等多种信号途径的交汇点，具有广泛的底物(包括多种转录因子)，参与多种信号的负调控[2-4]。GSK-3β在机体的表达可能会影响到胰岛素细胞信号的转导，因此其在2型糖尿病患者体内的异常表达成为研究2型糖尿病发病机制的一个重要标志物。现采用ELISA法检测2型糖尿病患者外周血单个核细胞GSK-3β蛋白表达及活性，探讨其与2型糖尿病患者病情变化的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年5～10月就诊于该院并经生化检查结合临床症状确诊为2型糖尿病的患者60例，符合世界卫生组织(WHO)糖尿病专家委员会提出的诊断及分型标准(1999)。根据血糖控制情况分为2组，实验1组为血糖未控制患者，共30例，男15例，女15例，平均年龄61.2(47～77)岁；实验2组为血糖控制者，共30例，男15例，女15例，平均年龄57.5(26～83)岁。健康对照组为该院体检中心的体检健康者，共30例，男15例，女15例，平均年龄55.7(26～86)岁，无糖尿病史。排除糖尿病急性并发症，心、肝、肺及非糖尿病性神经病变等急性发作者，急、慢性感染，恶性肿瘤等。所有研究对象均清晨抽取空腹静脉血，EDTA抗凝血2 mL，肝素抗凝血2 mL，采用肝素抗凝血做相关生化检查，使用EDTA抗凝血做糖化血红蛋白检测，在采血4 h内从剩余的EDTA抗凝血中提取外周血单个有核细胞。3组研究对象的年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 吸取EDTA抗凝血1 mL，使用Solarbio公司的人外周血淋巴细胞分离液提取人外周血单个核细胞，约取2×106个细胞，使用Solarbio公司的白细胞裂解液充分裂解淋巴细胞，把吹打之后的液体转移至EP管中，于-60 ℃冰箱保存，备用。

1.2.2 ELISA法检测 采用 ELISA 双抗体夹心法对标本中GSK-3β蛋白及活性水平进行定量分析。操作步骤严格按武汉华联科生物科技有限公司提供的试剂盒使用说明书进行。使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中人GSK-3β蛋白及活性水平。

表1 3组研究对象的一般资料结果比较±s)

2 结 果

2.1 糖尿病患者和健康者GSK-3β蛋白及活性水平结果比较 2型糖尿病患者GSK-3β蛋白水平比健康对照者升高，差异有统计学意义(P<0.05)；但GSK-3β活性水平与健康对照者比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 糖尿病患者和健康者GSK-3β蛋白及活性水平结果比较±s)

注：与健康对照组比较，*P<0.05。

2.2 3组研究对象GSK-3β蛋白及活性水平结果比较 实验1组GSK-3β活性水平比健康对照组和实验2组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；实验2组GSK-3β蛋白水平比健康对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组研究对象GSK-3β蛋白及活性水平结果比较

注：与健康对照组比较，*P<0.05；与实验2组比较，△P<0.05。

2.3 3组研究对象不同性别GSK-3β蛋白及活性水平结果比较 GSK-3β蛋白水平在3组不同性别者差异无统计学意义(P>0.05)。但实验1组男性GSK-3β活性水平比健康对照组男性升高,差异有统计学意义(P<0.05)，其他组间不同性别者差异无统计学意义(P>0.05)。 见表4、5。

表4 3组不同性别者GSK-3β蛋白水平结果比较

表5 3组不同性别者GSK-3β活性水平结果比较

注：与同性别健康对照组比较，*P<0.05。

3 讨 论

GSK-3β在细胞内作为众多信号转导通路的主要调控酶之一，可影响多种细胞的生长及凋亡，其在体内的作用各有利弊，过度激活或抑制都可能引起机体的病理改变[5]。Pearce等[6]研究发现，GSK-3β过表达对小鼠整体葡萄糖耐量具有一定的影响。一个选择性地在骨骼肌过度表达GSK-3β亚型的小鼠模型与非转基因对照组小鼠比较，雄性GSK-3β转基因小鼠糖原合成酶活性和糖原水平降低。口服葡萄糖耐量实验中，雄性GSK-3β转基因小鼠表现出极其强烈的葡萄糖反应及胰岛素水平升高，提示整体水平的胰岛素敏感性降低，并表现出血脂障碍。动物模型显示GSK-3β高表达与胰岛素敏感性降低具有相关性。Satish等[7]研究报道，GSK-3β是骨骼肌中葡萄糖合酶的主要调节基因，GSK-3β可一定程度抑制2型糖尿病患者骨骼肌及肝脏中胰岛素抵抗作用。凌振芬等[8]研究证实，2型糖尿病患者外周血白细胞中GSK-3β的酶活性明显高于健康者。杨莉莉等[5]研究发现，高糖环境下足细胞GSK-3β表达量增多，足细胞单层屏障功能受损，可能是引起糖尿病肾病的重要因素之一。 综上所述，大量的动物实验及人体指标监测都提示GSK-3β在机体中的异常表达与高血糖密切相关。

前期实验发现，2型糖尿病患者与健康对照者的GSK-3β基因相对表达量，差异无统计学意义(P>0.05)[9]。但本实验结果表明，2型糖尿病患者的外周血单个核细胞GSK-3β蛋白表达量较健康对照组明显增多(P<0.05)，但两者的活性水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。将2型糖尿病患者分为血糖未控制组(实验1组)和血糖控制组(实验2组)，提示实验1组的GSK-3β活性水平比实验2组和健康对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05),实验2组的GSK-3β活性水平与健康对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。实验2组的GSK-3β蛋白水平比健康对照组升高(P<0.05)，而与实验1组差异无统计学意义(P>0.05)。不同组别的性别者，男性GSK-3β活性水平相对增高，尤其以实验1组男性增高更甚，高于健康对照组男性(P<0.05)。

2型糖尿病患者GSK-3β基因并未发生结构或数量的改变，但在经过转录和翻译转变为蛋白质分子之后，出现蛋白质水平高表达。经过药物治疗后的2型糖尿病患者，血糖得到有效控制者GSK-3β蛋白水平仍高表达，但活性水平明显下降。说明2型糖尿病治疗对GSK-3β在机体的影响，更多的是其活性抑制，而对蛋白影响并不明显。提示同时检测GSK-3β在人外周血单个核细胞中的蛋白及活性水平有利于2型糖尿病的临床诊断及病情发展的观察。临床用药方面可考虑进一步探索抑制GSK-3β活性或蛋白合成的药物在2型糖尿病治疗中的应用。

[1]SutherlLI,CnhenP.Inactivationofglycogensynthasekinase-3betabyphosphorylation:newkinase connections in insulin and growth-factor signaling[J].Blood,1993,296:15-19.

[2]Frame S,Cohen P.GSK3 takes centre strage more than 20 years after its discovery[J].Biochem J,2001,359:1-16.

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[5]杨莉莉，刘章锁.GSK-3β在高糖环境下足细胞转分化效应中的作用[J].重庆医学，2015,44(12)：1609-1612.

[6]Pearce NJ,Arch JR,Clapham MP,et al.Development of glucose intolerance in male transgenic mice overexpressing human glycogen synthase kinase-3 on a muscle-specific promoter[J].Metabolism,2004,53 (11):1322-1330.

[7]Satish P,Bradley W.Doble A,et al.Tissue-specific role of glycogen synthase kinase 3 in glucose homeostasis and insulin action[J].Mol Cell Biol,2008,29(12):6314-6328.

[8]凌振芬,赵永波,沈翔.糖尿病患者外周血白细胞GSK-3及MMSE的测定[J].Nervous Diseases and Mental Health,2006,6(3)：172-174.

[9]谭婕，吴建华.2型糖尿病患者外周血有核细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)基因表达研究[J].现代检验医学杂志，2010,25(3)：58-60.

The protein expression and activity of glycogen synthase kinase 3β in the peripheral blood mononuclear cells of type 2 diabetic patients

TANJie1,WUJianhua2△,WANGJiangping2,ZOUJunqing2,MINGAnping2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHubeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine，Hubei430061,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory，HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan，Hubei430061,China)

Objective To investigate the clinical value of observing the differences of GSK-3β protein expression and activity level in the peripheral blood mononuclear cells between type 2 diabetes mellitus patients and healthy people.Methods Using ELISA to detect the GSK-3β protein expression and activity levels of people who contained 30 patients with type 2 diabetes whose blood glucose were not controlled (test group 1),30 cases of patients with type 2 diabetes whose blood glucose were controlled (test group 2) and 30 cases of healthy human and all the data were analyzed.Results The GSK-3β protein content of Type 2 diabetes mellitus group was higher than the control group(P<0.05),the activity level of GSK-3β in test group 1 was higher than the control group and test group(P<0.05).The GSK-3β protein content of test group 2 was higher than the control group(P<0.05).The male GSK-3β activity level in the test group 1 was higher than the men′s in the control group(P<0.05).Conclusion The GSK-3β protein content has a high expression in the type 2 diabetes mellitus patients.After drug treatment,the patients,who have controlled the blood glucose effectively,still showes high expression of the GSK-3β protein content,but the activity levels showes a significant decline.In male patients with type 2 diabetes blood sugar in the control group of GSK-3β showes significantly higher activity level.

type 2 diabetes mellitus; peripheral blood mononuclear cells; glycogen synthase kinase 3β

谭婕，女，主治医师,主要从事临床检验诊断学研究。△

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.011

A

1673-4130(2016)20-2831-03

2016-04-06

2016-06-11)