HPLC法测定鬼针草中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的含量

林忠宁，张珍丽，吴樟强，曾建伟

（1.福建省农业科学院农业生态研究所，福建福州350013；2.国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心，北京100081；3.福建中农牧生物药业有限公司，福建龙岩364001；4.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122）

HPLC法测定鬼针草中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的含量

林忠宁1，张珍丽2，吴樟强3，曾建伟4

（1.福建省农业科学院农业生态研究所，福建福州350013；2.国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心，北京100081；3.福建中农牧生物药业有限公司，福建龙岩364001；4.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122）

目的建立鬼针草中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的质量控制方法。方法用Agilent HC-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86），体积流量：1m L／m in，检测波长：256 nm，进样量：10μL，柱温：30℃。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的进样量在10.6～212 ng、21.5～430 ng、20.4～408 ng，与峰面积呈良好的线性关系；芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的平均回收率为99.61%、98.87%、98.09%。结论HPLC法简便、准确、可靠，可用于鬼针草中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的质量控制。

鬼针草；芦丁；金丝桃苷；异槲皮苷；高效液相色谱法

鬼针草（Bidens bipinnata L．）为菊科（Compositae）一年生草本，具有清热解毒、利湿退黄、散瘀活血的功效，主治感冒发热、湿热黄疸、风湿痹痛、痈肿疮疖。鬼针草的主要成分为总黄酮［1］，对心肌缺血再灌注大鼠、急慢性肝损伤小鼠有保护作用［2－5］，对肝纤维化大鼠有治疗作用［6－7］，能改善过敏性紫癜患者的微脉管炎症［8］，还有显著的抗关节炎作用［9］。鬼针草中的黄酮含量测定已有报道［10-14］，但未见测定鬼针草中芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷的报道。我们用福建和台湾的鬼针草样品，用HPLC法测定鬼针草中芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷的含量，为鬼针草的质量控制提供实验依据。

1　仪器与试剂

1.1仪器Agilent 1260高效液相色谱仪（G1311C四元泵，G7167B自动进样器，G1316A柱温箱，G1315D二极管阵列检测器）（美国安捷伦公司）；LK-1000A摇摆式中药粉碎机（上海隆拓仪器设备有限公司）；MS105DU十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AR2130千分之一电子天平（美国奥豪斯仪器有限公司）；KQ-500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q超纯水机（法国Millipore公司）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，甲醇、磷酸等为分析纯。

1.2试药芦丁（批号：100080-201507）、金丝桃苷（批号：111521-201503）、异槲皮苷（批号：111809-201501）（中国食品药品检定研究院）；鬼针草采自福建省和台湾省各地，经福建中医药大学杨成梓副教授鉴定为菊科植物鬼针草Bidens bipinnata L．的干燥全草。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Agilent HC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）；流量：1 mL／min；检测波长：256 nm：进样量：10μL：柱温：30℃。在此色谱条件下，混合对照品HPLC图见图1，供试品HPLC图见图2。

2.2混合对照品溶液精密称取芦丁对照品2.12 mg，金丝桃苷对照品2.15 mg，异槲皮苷对照品2.04 mg，分别置于10 mL瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得各自储备液。精密吸取3种储备液0.5、1、1 mL于同一10 m L瓶中，加入甲醇稀释并定容至刻度，得浓度分别为10.6、21.5、20.4μg／mL的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液精密称定鬼针草粉末2 g，置具塞锥形瓶中，加入60%乙醇25 mL，称定重量，500 W、50 kHz超声提取30 min，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4线性关系考察精密吸取混合对照品溶液1、5、10、15、20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X）为横坐标，进行回归分析，得到：

芦丁的回归方程为：

Y＝2.805 X+58.67 r＝0.999 5

金丝桃苷的回归方程为：

Y＝3.681 X+1.599 r＝0.999 4

异槲皮苷的回归方程为：

Y＝5.760 X+25.86 r＝0.999 8

芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷线性范围为10.6～212、21.5～430、21.5～430 ng。

2.5精密度试验精密吸取混合对照品溶液，重复进样6次，记录色谱峰面积，计算芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷峰面积的RSD为1.11%、1.38%、1.25%。

2.6稳定性试验取同一份供试品溶液，每隔2 h进样1次，共进样6次，记录色谱峰面积，计算鬼针草中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷峰面积的RSD为0.99%、0.31%、1.08%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.7重复性试验取同一批鬼针草粉末2 g，共6份，按2.3项的方法制备供试品溶液，进样，记录峰面积，计算鬼针草中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的含量平均值为0.09、0.12、0.11 mg／g，RSD为1.69%、1.24%、1.99%。

2.8回收率试验精密称取已知含量的鬼针草（福建永定）粉末1 g，6份，置具塞锥形瓶中，每份分别加入0.42 mL芦丁储备液、0.55 mL金丝桃苷储备液和0.53 mL异槲皮苷储备液，按2.3项的方法制备供试品溶液，进样，计算芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷的平均回收率，见表1。

2.9含量测定对采自福建和台湾各地的鬼针草药材，按2.3项的方法制备供试品溶液，按2.1项的色谱条件进样，测定，记录峰面积，并按外标法计算含量，结果见表2。

3　讨论

3.1检测波长的选择经二极管阵列检测器于200～400 nm在线扫描得知，3个对照品在256 nm、352 nm处有吸收峰，且前者吸光度大于后者。为提高检测灵敏度，我们选择256 nm为检测波长。

3.2流动相的优化由于被检测成分均为黄酮，存在酚羟基，呈弱酸性，故在流动相中加入0.1%磷酸以抑制解离，防止峰的拖尾。乙腈比例增大，金丝桃苷与芦丁的峰粘在一起，乙腈比例减小，金丝桃苷与异槲皮苷的峰粘在一起。为使较难分离的3个峰达到完全分离，最佳比例确定为乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）。

表1　芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷的回收率试验结果（n＝6）

表2　鬼针草中芦丁，金丝桃苷，异槲皮苷的含量mg／g

3.3提取条件考察比较回流提取与超声波提取，二者差别不大。考虑到超声波操作简单，受热温度低，故选择超声波提取。考察了不同浓度的乙醇提取效果，发现60%乙醇提取率最高，故选择60%乙醇作为提取溶剂。

3.4品质评价由表2可知，采自福建和台湾各地的鬼针草中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的含量差异较大。台湾产鬼针草中黄酮含量明显高于福建产的，这为评价海峡两岸鬼针草药材品质提供了一种参考。

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R284.2

B

1000-338X（2016）05-0023-03

2016-07-01

福建省科技项目资助课题（2014R1017-2），福州市科技计划项目资助课题（2013-G-107）

林忠宁（1972—），男，副研究员，主要从事药用植物资源与开发利用研究。

曾建伟（1976—），男，副研究员。E-mail：zjwtcm@qq.com