龙眼壳总黄酮的提取及其抗肿瘤的初步研究

宋佳玉，张清伟，刘金宝，郭秋兰

（河南漯河医学高等专科学校，河南漯河462002）

龙眼壳总黄酮的提取及其抗肿瘤的初步研究

宋佳玉，张清伟，刘金宝，郭秋兰

（河南漯河医学高等专科学校，河南漯河462002）

优化龙眼壳总黄酮提取工艺并对龙眼壳总黄酮体外抗肿瘤活性进行初步研究。采用乙醇回流提取方法提取龙眼壳总黄酮，在单因素分析的基础上行正交试验，结果表明：乙醇体积分数85％，加热回流提取温度70℃，料液比为1∶15（g/mL），加热回流提取次数为3次时为最佳提取工艺，此时龙眼壳总黄酮提取物得率约为4.17％，该提取物中总黄酮含量约为64.77％。体外试验表明龙眼壳总黄酮提取物可显著抑制卵巢癌SKOV3细胞和宫颈癌Hela细胞的生长，并呈现一定的浓度和时间依赖性。

龙眼壳；总黄酮；提取；抗肿瘤活性

龙眼俗称桂圆，又名木弹、骊珠、益智，其果肉为淡白色，肉质清甜。近年来一些学者认为龙眼肉能安神、补气血、益心脾，可用于治疗失眠、健忘、惊悸、怔忡、虚劳羸弱［1-3］。我国是龙眼的生产国，近些年来，总产量大幅度增长［4］。由于上市比较集中、贮运条件落后及储藏保鲜技术不足，只有部分龙眼作为水果直接销售，大量的龙眼用于加工龙眼糖水罐头、龙眼肉、龙眼膏等；而剩余的龙眼壳因为对其功效成分知之甚少而未能开发利用，目前都是作为废物直接丢弃。龙眼壳无毒、味甘、性温，其散邪祛风、聪耳明目，可治心虚头晕，研细治汤火伤亦佳［5］。最近研究表明龙眼壳提取物具有抗氧化、提高免疫力、抑制癌细胞增殖等活性［6-7］，已确定龙眼壳中含有核苷类、香豆素、多酚、萜类、糖类等［8-10］，而目前对龙眼壳中黄酮的提取研究报道较少。本研究从龙眼壳中提取了总黄酮，进一步优化了其提取工艺，并初步研究了其体外抗肿瘤活性，为龙眼壳进一步开发利用提供了参考。

1　材料、试剂与仪器

龙眼：采自福建泉州。

亚硝酸钠、氢氧化钠、乙醇、硝酸铝均为国产分析纯；芦丁标准品（纯度98％）：中国药品生物制品检定所；5-Fu注射液：上海旭东海普药液有限公司。

ALPHA1-2LD plus冷冻干燥仪：德国MARTIN CHRIST公司；RE-3000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器公司；AL104电子天平：上海昕仪仪器仪表有限公司；101-2B电热鼓风干燥箱：上海市实验仪器总厂；WFJ-中草药粉碎机：江阴市辉煌机械制造有限公司；HH-1恒温水浴锅：陕西太康生物科技有限公司；AEB-220电子天平：日本岛津公司。

2　方法

2.1龙眼壳总黄酮提取工艺流程

龙眼壳粉末→浸泡→加热回流提取→提取液→浓缩→冷冻干燥→龙眼壳总黄酮提取物

2.2龙眼壳总黄酮提取物得率的单因素试验

分别研究料液比（原料质量：溶剂体积）、乙醇体积分数、加热回流提取温度、回流提取次数对龙眼壳总黄酮提取物得率的影响。

龙眼壳总黄酮提取物得率/％=m/（10×W）

式中：m为冷冻干燥得到的龙眼壳总黄酮的质量，mg；W为龙眼壳粉末的质量，g。

2.3龙眼壳提取物中总黄酮含量的测定

采用聚酰胺吸附-硝酸铝显色法，按照参考文献［11-12］，制作芦丁标准品标准曲线，得线性回归方程A= 1.842 9C－0.000 4，A为510 nm处吸光度值，C为质量浓度（mg/mL），线性范围为0～0.5mg，相关系数R2为0.999 9。

2.4龙眼壳总黄酮提取物体外抗肿瘤试验

按照参考文献［13-14］测定龙眼壳总黄酮提取物对卵巢癌SKOV3细胞和宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用。调整卵巢癌SKOV3细胞和宫颈癌Hela细胞浓度为2×103/mL分别接种于96孔板中，每孔100μL。试验分为阴性对照组、提取物组、5-Fu组，每组设5个复孔并设空白调零孔。24 h后，阴性对照组加200μL培养液，提取物组分别加入200μL终浓度为0.1、0.3、0.6、0.9、1.2mg/mL总黄酮提取物，5-Fu组加200μL终浓度为0.38mg/mL 5-Fu，分别培养24、48、72 h后，加入MTT溶液20μL，培养4 h后加入150μL二甲基亚砜，用酶联检测仪在490 nm处测定各孔的光密度值（OD）。计算细胞增殖抑制率（IR）。试验重复3次。

2.5统计学处理

3　结果与分析

3.1影响龙眼壳总黄酮提取物得率的单因素试验

3.1.1乙醇体积分数对龙眼壳总黄酮提取物得率的影响

在料液比1∶5（g/mL）、提取温度50℃、回流提取3次条件下，研究乙醇体积分数对龙眼壳总黄酮提取物得率的影响，见图1。

由图1可知：提取物得率随着乙醇体积分数的增大而升高，当乙醇体积分数为85％时总黄酮得率最大，而当再增加乙醇体积分数时，其得率反而降低。造成这种现象的原因可能是由于乙醇体积分数不同其极性也不同，85％乙醇的极性和龙眼壳总黄酮的极性相似，根据相似相容原理乙醇分数为85％时，总黄酮得率最大，故在正交试验设计中乙醇体积分数设置为75％、85％、95％。

图1　乙醇体积分数对总黄酮提取物得率的影响Fig.1 Effectsof different volum e fraction of ethanolon theyield of flavonoids

3.1.2加热回流提取温度对龙眼壳总黄酮提取物得率的影响

在乙醇体积分数85％、料液比1∶5（g/mL）、回流提取3次条件下，研究加热回流提取温度对龙眼壳总黄酮提取物得率的影响，见图2。

图2　加热回流提取温度对总黄酮提取物得率的影响Fig.2 Effectsof extraction temperatureon the yield of flavonoids

由图2可知：提取物得率随着温度的升高而增加，当加热回流提取温度为70℃时得率最多，而当再增加温度时，其得率反而降低。可能是因为随着温度的升高，总黄酮向溶液溶出量增加，当温度达到70℃时，得率最大，当温度大于70℃时，得率反而下降，可能是由于温度较高时蛋白质变性，影响了细胞的破裂，阻碍了总黄酮的溶出，从而降低了总黄酮提取物的得率。故在正交试验设计中温度为50、60、70℃。

3.1.3加热回流提取次数对龙眼壳总黄酮提取物得率的影响

在乙醇体积分数85％、料液比1∶5（g/mL）、回流提取温度为50℃条件下，研究加热回流提取次数对龙眼壳总黄酮提取物得率的影响，见图3。

由图3可知：总黄酮提取物得率随着提取次数的增加而增加，当提取次数等于3次时，提取量趋于稳定，说明当提取次数为3次时，总黄酮已被充分提取。故从效率出发，在正交试验设计中提取次数设为1、2、3次。

3.1.4料液比对龙眼壳总黄酮提取物得率的影响

在乙醇体积分数85％、提取温度50℃、回流提取3次条件下，研究料液比对龙眼壳总黄酮提取物得率的影响，见图4。

图3　加热回流提取次数对总黄酮提取物得率的影响Fig.3 Effectsof extraction timeson the yield of flavonoids

图4　料液比对总黄酮提取物得率的影响Fig.4 Effectsof the ratio ofmaterialand liquid on the yield of flavonoids

由图4可知：随料液比的增加，龙眼壳总黄酮提取物得率逐渐升高，但当料液比大于1∶15（g/mL）时，提取量趋于平稳。说明随着料液比增加，总黄酮溶出量逐渐增大，当其充分溶出后，即使加大料液比，总黄酮提取物得率变化不明显。基于成本考虑，正交试验设计中料液比设置为1∶5、1∶10、1∶15（g/mL）。

3.2正交试验优化龙眼壳总黄酮提取工艺

在单因素试验的基础上，选择乙醇体积分数、加热回流提取温度、加热回流提取次数、料液比作为考察因素，进行L9（34）正交试验，试验因素和水平见表1，结果与分析见表2。

由表2可知，影响龙眼壳总黄酮提取物得率的影响因素顺序为：乙醇体积分数（A）＞加热回流提取温度（B）＞料液比（D）＞加热回流提取次数（C），龙眼壳总黄酮提取的最佳工艺条件为：A2B3C3D3，即乙醇体积分数85％，加热回流提取温度70℃，料液比为1∶15（g/mL），加热回流提取次数为3次。

表1　正交试验因素水平设置表Table1 Factorsand levelsof orthogonalexperiment

表2　L9（34）正交试验结果Table2 Resultsof L9（34）orthogonalexperim ent

3.3龙眼壳提取物中总黄酮含量

根据最佳提取条件进行平行试验3次，龙眼壳总黄酮提取物得率为4.17％。按照聚酰胺吸附-硝酸铝显色法检测龙眼壳提取物中总黄酮含量约为64.77％。

3.4龙眼壳总黄酮提取物对卵巢癌SKOV3细胞和宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用

龙眼壳总黄酮提取物对卵巢癌SKOV3细胞和宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用，见表3、表4。

表3　龙眼壳总黄酮提取物对卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制作用（±s，n=5）Tab le3 Inhibitory effectof longan shell flavonoidson SKOV3（±s，n=5）

表3　龙眼壳总黄酮提取物对卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制作用（±s，n=5）Tab le3 Inhibitory effectof longan shell flavonoidson SKOV3（±s，n=5）

分组浓度/（mg/mL）24 h 48 h 72 h ％OD IR/％OD IR/％OD IR/％阴性对照-0.33±0.023-0.47±0.019-0.65±0.029-5-Fu 0.38 0.17±0.00*44.48 0.18±0.011*61.70 0.05±0.012*92.22提取物0.10 0.37±0.014-0.40±0.014 14.89 0.49±0.016*24.62

续表3龙眼壳总黄酮提取物对卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制作用（±s，n=5）Continue table3 Inhibitory effectof longan shell flavonoidson SKOV3（±s，n=5）

续表3龙眼壳总黄酮提取物对卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制作用（±s，n=5）Continue table3 Inhibitory effectof longan shell flavonoidson SKOV3（±s，n=5）

注：*表示与阴性对照组比较，P＜0.05；-表示对肿瘤细胞无抑制作用。

分组浓度/（mg/mL）24 h 48 h 72 h ％OD IR/％OD IR/％OD IR/％阴性对照0.30 0.34±0.019-0.37±0.020 21.27 0.45±0.017*30.77 5-Fu 0.60 0.32±0.015 3.03 0.35±0.013 25.53 0.35±0.015*46.15提取物0.90 0.30±0.020 9.09 0.30±0.011*36.17 0.28±0.016*56.92 1.20 0.28±0.023 15.15 0.24±0.020*48.94 0.21±0.019*67.69

表4　龙眼壳总黄酮提取物对宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用（±s，n=5）Table4 Inhibitory effectof longan shell flavonoidson Hela（±s，n=5）

表4　龙眼壳总黄酮提取物对宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用（±s，n=5）Table4 Inhibitory effectof longan shell flavonoidson Hela（±s，n=5）

注：*表示与阴性对照组比较，P＜0.05；-表示对肿瘤细胞无抑制作用。

分组浓度/（mg/mL）24 h 48 h 72 h ％OD IR/％OD IR/％OD IR/％阴性对照-0.33±0.023-0.47±0.019-0.65±0.029-5-Fu 0.38 0.17±0.00*44.48 0.18±0.011*61.70 0.05±0.012*92.22提取物0.10 0.27±0.015-0.40±0.019 14.89 0.47±0.020*27.69 0.30 0.20±0.020-0.35±0.022*25.53 0.42±0.015*35.38 0.60 0.18±0.017-0.31±0.012*30.04 0.35±0.021*46.15 0.90 0.30±0.025 9.09 0.28±0.014*40.42 0.29±0.018*55.38 1.20 0.27±0.030 18.18 0.23±0.023*51.06 0.18±0.019*72.30

药物作用24、48、72 h后，MTT试验结果显示龙眼壳总黄酮提取物对卵巢癌SKOV3细胞和宫颈癌Hela细胞有增殖抑制作用，且呈一定的浓度和时间依赖性。

4　讨论

本试验通过对乙醇体积分数（A）、加热回流提取温度（B）、加热回流提取次数（C）、料液比（D）进行单因素试验和正交试验，最终确定龙眼壳总黄酮最佳提取工艺为A2B3C3D3即乙醇体积分数85％，加热回流提取温度70℃，料液比为1∶15（g/mL），加热回流提取次数为3次。按此最优组合平行试验3次，龙眼壳总黄酮提取物平均得率为4.17％。按照聚酰胺吸附-硝酸铝显色法检测该龙眼壳提取物中总黄酮含量约为64.77％。

体外抗肿瘤结果表明，龙眼壳总黄酮提取物可明显抑制卵巢癌SKOV3细胞和宫颈癌Hela细胞的增殖且呈现出一定浓度和时间依赖性，当总黄酮提取物的浓度为1.2mg/mL，作用时间为72 h时抑瘤率分别为67.69、72.30％，可见没有纯化的龙眼壳总黄酮提取物具有良好的抗肿瘤活性，龙眼壳作为天然的抗肿瘤药物具有很好的开发潜力。

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The Extraction of Longan Shell Flavonoids and Prelim inary Study on its Anti-tumor Activity

SONG Jia-yu，ZHANG Qing-wei，LIU Jin-bao，GUO Qiu-lan
（Luohe Medical College，Luohe 462002，Henan，China）

Extraction process condition was optimized and the antitumor activity in vitro of Longan shell flavonoidswas studied.On the basis of single factor experiments，orthogonal testwas used.The optimal conditions of extraction were obtained as follows：alcohol volume fraction 85％，3 times of extraction，extraction temperature 70℃，the ratioofmaterialand liquid 1∶15（g/mL）.Theyield of longan shell flavonoidsextractswas about4.17％，the total contentof flavonoids in the extractswasabout64.77％.In vitro，the resultsshowed that longan shell flavonoids significantly inhibited the growth of SKOV3 and Hela cells，and showed a certain concentration and time dependence.

longanshell；flavonoids；extraction；antitumoractivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.012

宋佳玉（1981—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：肿瘤药理。

2015-11-11