异育银鲫嗜水气单胞菌的分离鉴定与病理组织学观察

耿昕颖，王家祯，董文龙，单晓枫，马红霞，高云航

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118）

异育银鲫嗜水气单胞菌的分离鉴定与病理组织学观察

耿昕颖，王家祯，董文龙，单晓枫，马红霞，高云航

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118）

为鉴定吉林省某养殖场所养殖异育银鲫（carassius auratus gibelio）死亡原因，在濒死鱼的肝、胰、脾、肾脏分离得到一株优势菌，经细菌形态、常规理化特性鉴定、人工感染试验、16S rRNA基因序列测定、病理解剖学及病理组织学观察，结果表明：分离株为气单胞菌属的嗜水气单胞菌，并将其命名为JL-PW-3。该分离株对环丙沙星、氟苯尼考、强力霉素、氯霉素等高度敏感；对庆大霉素、阿米卡星、阿莫西林、阿奇霉素、红霉素、恩诺沙星、磺胺间甲氧嘧啶等完全耐药。

异育银鲫；嗜水气单胞菌；分离鉴定；病理学

异育银鲫是由方正银鲫为母本，以兴国红鲤为父本，经人工繁育的子代，具有生长快、个体大、抗病性强等特点，是我国著名的淡水鱼类之一［1］。几年来随着养殖规模的扩大，加之水体环境的恶化，各种病害不断出现，给我国异育银鲫的养殖带来巨大危害，造成了严重的经济损失。

嗜水气单胞菌在世界各地均有分布，是人兽共患的条件性致病菌［2-4］，并能够引起多种淡水鱼类大量死亡［5-6］，给我国整个水产行业都造成了巨大的损失。2013年吉林省某养殖场的异育银鲫自然发病并出现大批量死亡，病鱼的主要症状为眼部突出，嘴角、体表、鳍条基部出血，腹部肿胀，肛门红肿、外凸，尾鳍出血、溃烂，严重病鱼体表鳞片脱落。本试验从具有典型症状的鲫鱼体内分离出该致病菌，对其菌落形态、生理生化特性鉴定，结合分子生物学16S rRNA核苷酸同源性分析和系统发育构建树对病原菌进行鉴定，并对其所导致的病理学变化及药敏性检测进行研究，以便为鲫鱼的病害防治提供科学依据。

1　材料

1.1病料来源及试验动物吉林省某养殖场养殖的异育银鲫自然发病并出现大量死亡，体重200～250 g，症状表现为鳃和鳍条出血、充血，腹部肿胀，肠道充血并伴有腹水，疑似嗜水气单胞菌感染。供感染的试验鱼，购自吉林省某养殖场的健康异育银鲫，体重60～70 g。

1.2培养基、主要试剂及药品普通琼脂培养基、细菌微量生化鉴定管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；甲醛、无水乙醇、二甲苯、石蜡、苏木精染液，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、强力霉素、阿莫西林、红霉素、阿奇霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、氯霉素、磺胺间甲氧嘧啶，均由海洋医化生物科技有限公司惠赠。

2　方法

2.1病原菌的分离培养及形态观察在无菌条件下取典型症状的病异育银鲫，以肝、胰、脾、肾脏为样本划线接种于普通琼脂固体培养基上，30℃培养24 h做细菌分离，待长出菌落后，挑取单个菌落获取纯培养物，制成涂片标本，经革兰染色后，镜检细菌形态。

2.2生理生化反应纯化后的细菌经30℃培养后分别接种微量生化反应管，按说明书操作进行。同时进行精氨酸双水解酶试验、赖氨酸脱羧酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验、V-P试验、M.R.试验、H2S固体穿刺试验、氧化酶试验、吲哚试验、肌醇试验，30℃培养24～72 h，观察并记录结果。

2.3人工感染试验

2.3.1人工注射感染试验采用菌落计数法将已培养的菌液浓度稀释为5个梯度：4.725×104、4.725× 105、4.725×106、4.725×107、4.725×108CFU/mL。试验选用暂养1周的健康异育银鲫，菌液腹腔注射30尾鱼，0.15 mL/尾；同时设立同剂量无菌生理盐水作为试验对照组。每组试验鱼隔离养于恒温25℃玻璃缸中，正常饲养管理，连续观察1周，并记录其感染发病时间与死亡情况。

2.3.2人工再感染试验在人工感染患病濒死的试验鱼中，取临床症状与自然患病濒死鱼症状相似的鱼肝、脾、肾脏和肠道等组织进行常规再分离，挑取与原人工感染试验菌落形态特征一致的单菌落，进行人工再感染试验，观察鱼的活动情况并作好记录。

2.4病理学观察对主要病/死异育银鲫进行临床和主要病理变化的观察。采集发病症状明显异育银鲫的肝、脾、肾、肠道等主要组织，10%甲醛进行固定并对相应的组织进行常规的石蜡切片，常规H.E.染色，在显微镜下进行病理组织学观察。

2.516S rRNA基因序列测定将纯化后的菌株接种于普通营养肉汤培养基上30℃培养12 h后，提取细菌DNA。16S rRNA基因PCR扩增引物分别为：TY-1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、TY-2：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，以细菌DNA为模板，TY-1/TY-2为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。将PCR回收产物与pMD18T-载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并将阳性克隆送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序的结果利用NCBI BLAST软件进行序列比较分析。

2.6药物敏感性试验参照CLSI推荐的微量肉汤稀释法检测分离株对庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、强力霉素、阿莫西林、红霉素、阿奇霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、氯霉素、磺胺间甲氧嘧啶的MIC值，以大肠杆菌ATCC®25922作为质控株，将培养物于30℃培养18～24 h观察结果，结果遵循CLSI的临界浓度作为判断标准。

3　结果与分析

3.1细菌的分离及形态特性分离菌株在普通营养琼脂培养基上经30℃恒温培养24 h后菌落为圆形，中央隆起，边缘整齐，半透明呈浅黄色，芳香味，无水溶性色素，生长丰盛（见前插彩版图1）。在普通肉汤培养基中经30℃恒温培养24 h后呈均匀浑浊生长，管壁有菌膜，管底有菌体沉淀，摇晃时易碎呈线状上升并消散。对分离纯化单菌落进行革兰染色，在40倍显微镜下观察，结果为革兰阴性菌，短杆状，两端钝圆或直平（见前插彩版图2）。

3.2细菌的生理生化鉴定生理生化鉴定结果显示，分离株发酵葡萄糖、L-阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇等，不发酵鼠李糖、木糖。精氨酸双水解酶、赖氨酸脱氢酶、鸟氨酸脱氢酶、VP试验、M.R.试验、氧化酶、H2S固体穿刺试验均为阳性，吲哚试验、肌醇为阴性。

3.3人工注射感染试验结果

3.3.1人工注射感染对从病鱼分离出来的菌株进行人工悬菌液感染试验，结果不同接菌浓度出现不同程度的死亡，当菌液浓度为4.725×108CFU/mL时，试验组异育银鲫在96 h内全部死亡，而对照组在试验观察期内则未出现任何死亡现象（表1）。

表1　菌株人工注射感染鲫鱼

3.3.2人工注射再感染试验在试验濒死鱼的肝、脾、肾、肠道中经常规分离培养可分别得到与病原菌一致的菌株，经再次感染又可分离到与病原菌一致的菌株，说明分离得到的菌株为鱼的致病菌。

3.4病理学观察结果

3.4.1临床症状和剖检变化症状主要表现为病鱼口腔、头部、眼眶、鳃盖边缘、鳍条基部及鱼尾边缘充血，腹部肿胀，肛门红肿，剖检后发现鱼鳃充血、出血，腹腔内有大量淡黄色积液，肠道充血发红，肝胰脏颜色变浅，脾、肾颜色加深等症状。

3.4.2病理组织切片观察结果与健康鱼肠道相比较，感染鱼肠绒毛崩解，肠腔内充满坏死的细胞碎片，肠黏膜上皮细胞变性、坏死脱落，杯状上皮细胞增多，固有层和黏膜下层毛细血管扩张、淤血，有少量的炎性细胞和血细胞浸润，肠肌纤维扭曲紊乱，加粗水肿（见前插彩版图3）。

与健康鱼肝脏相比较，病鱼肝组织中央静脉扩张并有大量血细胞，肝细胞肿胀，局部有空泡，肝窦扩张、淤血，其内充满完全溶解的红细胞，少量鱼肝组织可见局灶性坏死，尚未发现严重病变鱼含有双核细胞（见前插彩版图4）。

与健康鱼肾脏相比较，感染鱼肾脏失去原有的组织结构，崩溃解体，有大面积的坏死细胞，肾小管上皮细胞肿胀，排序紊乱，严重区域肾小球崩解、坏死，血管球肿胀，毛细血管扩张，可见较多被H.E.染色成棕黄色样色素沉着（见前插彩版图5）。

与健康鱼相比较，感染鱼充血，脾髓充满红细胞，脾脏组织结构紊乱，崩溃解体，有大量空泡样结构，细胞核破裂溶解，脾小体结构不清，严重区域可见大量被H.E.染色成棕黄色血源性色素沉着（见中插彩版图6）。

3.516S rRNA基因序列测定及同源性分析PCR扩增出1 450 bp的片段，与预期结果一致（如图7）。将测序结果与GenBank上已发表的几株嗜水气单胞菌的16S rRNA序列进行同源性分析，该菌与GenBank所发表的嗜水气单胞菌的16S rRNA同源性最高，达到了99%。

图7　分离菌株J L-PW-3的PCR扩增

3.6药物敏感性试验在本试验中采用微量肉汤稀释法来测定分离株的药物敏感性，结果如表2所示。

4　讨论

图8　菌株J L-PW-3 16S rRNA基因序列发育树

表2　11种抗菌药物对分离株的MIC

嗜水气单胞菌对淡水鱼具有强致病性，祖国掌等报道了安徽省草鱼细菌性败血症的主要致病菌为嗜水气单胞菌，造成了鱼类大量死亡［7］。王友娟等［8］在辽宁地区发现51株嗜水气单胞菌引起淡水鱼致病死亡，其中有24株以全身出血为主要症状，17株可引起鱼体表溃烂，腹部肿胀，由此可见，不同地区嗜水气单胞菌均会给水产养殖业造成不同程度的危害。本研究通过病理组织学观察可发现，病死鱼主要病理变化为全身各细胞肿胀，坏死脱落，特别是肝，脾，肾，肠道病变较为严重，导致体内钠、钾代谢平衡失调，所以腹水严重，管腔变窄，导致血流发生障碍，致使循环血量降低，血流量减少，大量红细胞侵润，周围淋巴细胞减少造成了鱼体自身免疫力下降，加速了试验鱼的死亡，肠肌纤维紊乱、扭曲成空泡样结构，严重影响了肠道消化吸收功能，从而导致异育银鲫摄食量减少。本试验已证实造成异育银鲫死亡的致病菌为嗜水气单胞菌，其预防及防治措施还有待进一步研究和探索。

Vivekanandhan等［9］利用15种抗生素对315株嗜水气单胞菌进行药物敏感性试验，结果表明，对多粘霉素B，万古霉素，利福平等7种抗菌药物产生了高度耐药性，且出现不同程度的多重耐药。目前我国水产疫苗相对较少，抗菌药物仍是治疗嗜水气单胞菌的主要方法，但药物使用过多、滥用，导致抗药性的菌株不断增多。本试验采用了11种抗生素对分离的致病株JL-PW-3进行药敏试验，结果该菌对8种抗生素等具有耐药性，从耐药性结果来看，该菌的耐药性不容乐观，可能与耐药性的直接和间接传播有关，后续可对其耐药机制进一步的研究。洪经等［10］对国内不同地区40株嗜水气单胞菌进行耐药机制的研究发现，嗜水气单胞菌耐药情况严重，且多重耐药普遍抗菌药物的过多使用会导致鱼类致病菌出现更多的耐药情况，导致想要获得良好的治疗效果需结合有效的药敏试验科学、合理的用药。

［1］沈怀舜，杨官品，许璞.异育银鲫准回交世代经济性状优势的遗传基础研究［J］.中国海洋大学学报，2005，35（2）：219-214.

［2］Khushiranabi R，Girisha S K，Bhowmick P P.Prevalence of different outer membra-ne proteins in isolates of Aeromonas species［J］.Word Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24：2263-2268.

［3］李鹏，陶茂晖，李晓云，等.雏鸡嗜水气单胞菌感染的诊断［J］.畜牧与兽医，2005，37（6）：36-37.

［4］刘堂水，汪成竹，陈昌福.斑点叉尾鮰细菌性病原的分离与鉴定［J］.华中农业大学学报，2006，25（5）：550-554.

［5］周飞，刘娟，黎德兵.黄鳝嗜水气单胞菌的分离鉴定及中药体外抑菌效果研究［J］.中国畜牧兽医，2010，37（2）：135-137.

［6］孟彦，肖汉兵，张林，等.施氏鲟出血性败血症病原菌的分离和鉴定［J］.华中农业大学学报，2007，26（6）：822-826.

［7］祖国掌，余为一，李槿年.草鱼细菌性败血症的诊断及流行病学调查［J］.淡水渔业，2000，30（5）：35-37.

［8］王友娟，李荣峰，李华，等.辽宁地区养殖淡水鱼感染嗜水气单胞菌的流行病学调查［J］.中国农业科技导报，2012，14（4）：128-134.

［9］Vivekanandhan G，Savithamani K，Hatha AAM，et al.Antibiotic resistance of Aeromorras hydrophila isolated form marketed fish and prawn of South India［J］.Food Microbiol，2002，76（1/2）：165-168.

［10］洪经，潘连德.鱼源嗜水气单胞菌质粒的指纹图谱及其与耐药性的关系［J］.水产学报，2010，34（12）：1908-1915.

Isolation and Identification ofAeromonas hydrophliaand histopathological examination

GENG Xin-ying，WANG Jia-zhen，DONG Wen-long，SHAN Xiao-feng，MA Hong-xia，GAO Yun-hang
（College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

In order to identify the cause of death of carassius auratus gibelio in farms in Jilin Province，a dominant bacterium was isolated from liver，hepatopancreas，spleen and kidney in dying fish.All the results of morphological observation，physical and biochemical identification assays，artificial infection test，determination of 16S rRNA gene sequences and pathological and histological observation conformed that this bacterium was Aeromonas hydrophlia，named as JL-PW-1.This isolate was highly sensitive to ciprofloxacin，florfenicol，doxycycline，and chloramphenicol，but completely resistant to gentamicin，amikacin，amoxicillin，azithromycin，erythromycin，enrof-loxacin，sulfamono methoxine and other drugs.

carassius auratus gibelio；Aeromonas hydrophlia；isolated identification；pathology

GAO Yun-hang

S943

A

0529-6005（2016）04-0109-03

2015-03-25

国家自然科学基金项目（31201927）；吉林省重点科技攻关项目（20150204065NY）

耿昕颖（1993-），女，硕士生，研究方向为动物疫病防治，E-mail：1160455285@qq.com

高云航，E-mail：gaoyunhang@163.com