美洲雁中鸭疫里默菌的分离鉴定及耐药性分析

陈　卓，罗　静，苏　文，张国钢，何宏轩

（1.中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 全国鸟类环志中心 国家林业局森林保护学重点实验室，北京海淀 100091；2.中国科学院动物研究所 动物生态与保护学重点实验室 野生动物疫病研究中心，北京 朝阳 100101）

美洲雁中鸭疫里默菌的分离鉴定及耐药性分析

陈卓1，罗静2，苏文2，张国钢1，何宏轩2

（1.中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 全国鸟类环志中心 国家林业局森林保护学重点实验室，北京海淀 100091；2.中国科学院动物研究所 动物生态与保护学重点实验室 野生动物疫病研究中心，北京 朝阳 100101）

从北京密云某美洲雁养殖场的发病美洲雁的肝脏中分离病原菌，并对病原菌进行染色镜检、生化检测及PCR检测，鉴定出1株鸭疫里默菌，对其进行耐药性分析，结果显示，该菌株对阿莫西林/克拉维酸、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢唑啉、庆大霉素、氨苄西林高敏；对氯霉素、环丙沙星和阿米卡星中敏；对卡那霉素、四环素和复方新诺明耐药。

美洲雁；鸭疫里默菌病；分离鉴定；耐药性

鸭疫里默菌（Riemerella anatipestifer，RA）病，是感染鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种接触性传染病，又称鸭传染性浆膜炎（Infectious serositis）、新鸭病（New duck syndrome）或鸭败血症（Duck septicemia），由鸭疫里默菌引起［1］。目前已从家鸭、鹅、火鸡以及野鸟中分离到鸭疫里默菌［1-3］。该病的临床症状主要有流鼻液、呼吸困难、鼻窦肿胀、神经紊乱和腹泻等，并引起雏鸭肝周炎、纤维心包炎、关节炎和气囊炎，有时也会出现无临床症状的呼吸道感染［1，4-5］。由于其高发病率和死亡率，是目前危害养殖产业最为严重的细菌性传染病之一。外膜蛋白A（ompA）基因，是RA的保守基因，其编码蛋白可诱导保护性免疫反应，对细菌的粘附性和致病性起重要作用［6-7］。本试验对北京密云某美洲雁养殖场中的病死美洲雁进行了细菌检测，分离鉴定出鸭疫里默菌，并进行耐药性分析，对鸭疫里默菌病的防制提供依据。

1　材料

1.1主要材料北京密云某美洲雁养殖场的发病美洲雁；对照所用大肠杆菌和鸭疫里默菌均为实验室以往所分离到的菌株。

1.2主要试剂巧克力琼脂培养基，含5%犊牛血清的营养肉汤培养基，MH培养基，生理生化鉴定试剂，均购自北京陆桥生物技术有限责任公司；药敏纸片，购自北京天坛药物生物技术开发公司；2×Taq PCR Master Mix、细菌基因组DNA提取试剂盒，均购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA Marker DL-2 000，购自宝生物工程（大连）有限公司；引物由北京华大基因合成。

2　方法

2.1细菌分离培养无菌条件下，采集病死美洲雁肝脏组织，接种于巧克力琼脂培养基上，放入厌氧罐中37℃培养24～48 h，观察细菌生长状况，挑取单菌落在营养肉汤培养基中进行增菌培养并保种。

2.2染色镜检挑取单菌落，进行革兰染色，并镜检观察。

2.3生化试验挑取纯培养的单菌落到生理盐水管中，调节麦氏度0.5～0.7，吸0.5 mL菌液接种于生化鉴定管中，37℃培养24～48 h后判定结果。判定标准参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第九版），及《常见细菌系统鉴定手册》建立的鉴定技术体系进行鉴定。

2.416S rDNA扩增参照细菌基因组DNA提取试剂盒，提取大肠杆菌、鸭疫里默菌参照株和分离菌株的DNA作为模板。利用16S rDNA基因的通用引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行扩增细菌d的16S rDNA。扩增体系为50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL；ddH2O 21 μL；上下游引物各1 μL；DNA模板2 μL；共50 μL。程序：94℃30 s；94℃20 s，55℃45 s，72℃90 s，共30个循环；72℃10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。后送往北京华大基因进行测序，测序结果在Gen Bank（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）中比对鉴定。

2.5ompA基因扩增根据GenBank中鸭疫里默菌的ompA基因序列设计合成下列引物：5′-CACTTTTCTGTCTTTCATTC-3′，5′-CAACTATTTGAGACACGACT-3′。以大肠杆菌、鸭疫里默菌参照株和分离菌株的DNA作为模板进行扩增。扩增体系为：2× Taq PCR Master Mix 25 μL；ddH2O 20 μL；上下游引物各1 μL；DNA模板3 μL；共50 μL。程序：95℃30 s；95℃20 s，53.5℃30 s，72℃60 s，共30个循环；72℃10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.6药敏试验采用纸片扩散法，分别用灭菌棉拭子蘸取麦氏度为0.5～0.7的菌液，均匀涂布MH平板，后分别贴上选择的药敏纸片，每块平板5片，35℃培养18～24 h判定结果，判定标准参照美国试验时标准委员会（NCCLS）。

3　结果

3.1病原菌形态、染色和镜检分离到的疑似菌落在巧克力琼脂培养基上，为半透明、湿润、光滑、露滴状、直径为0.5～1 mm的菌落。革兰染色镜检，为革兰阴性菌，单个存在。

3.2生化鉴定结果生化鉴定表明，分离出的疑似细菌不分解乳糖、棉子糖、阿拉伯糖、果糖、蔗糖和葡萄糖；不能利用阿拉伯醇、甘露糖、肌醇、酒石酸盐、醋酸盐、胆汁肉汤、乙酰胺肉汤；明胶液化试验为阳性；硝酸盐还原试验、甲基红试验、V-P试验均为阴性；不产生H2S（见表1）。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第九版），对比生化鉴定结果，同时结合菌体以及菌落形态，初步鉴定分离病原菌为鸭疫里默菌。

表1　细菌生化鉴定结果

3.316S rDNA扩增结果扩增结果如图1，大肠杆菌、RA对照株和试验分离株均扩增出1 400 bp左右的条带，扩增的目的片段序列在NCBI上经Blast进行序列同源性分析，显示其与已报道的鸭疫里默菌同源性为99%（序列号为KM893400.1，JX195682.1，CP003388.1）。

图1　PCR扩增16SrDNA基因

3.4ompA基因扩增结果ompA基因扩增结果见图2，RA对照株和试验分离株均扩增出大小为958 bp的条带，与预期大小一致。而大肠杆菌和阴性对照没有扩增出特异性条带。

图2PCR扩增ompA基因

3.5药敏结果药敏试验结果（见表2），分离的RA对卡那霉素、四环素和复方新诺明耐药；对阿莫西林/克拉维酸、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢唑啉、庆大霉素、氨苄西林高敏；对氯霉素、环丙沙星和阿米卡星中敏。

表2　分离菌对抗生素的敏感性结果

4　讨论

鸭疫里默菌是危害鸭类养殖产业的重要病原之一，本试验从病死美洲雁中分离纯化细菌，通过传统的形态学观察及生化分析，快速缩小病原范围，初步鉴定出鸭疫里默菌。之后通过对疑似鸭疫里默菌进行16S rDNA测序，显示其与鸭疫里默菌的同源性为100%。最后利用鸭疫里默菌的保守基因ompA对分离菌做进一步验证，确定分离到的菌株为鸭疫里默菌，此方法快速准确，操作简单，能够及时准确鉴定出鸭疫里默菌，从而减少对养殖业带来的损失。

在本实验中，对分离的鸭疫里默菌进行抗生素耐药性分析，结果显示分离出的鸭疫里默菌对阿莫西林/克拉维酸、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢唑啉、庆大霉素、氨苄西林高敏；对氯霉素、环丙沙星和阿米卡星中敏；对卡那霉素、四环素和复方新诺明耐药。以往湖南分离的菌株对恩诺沙星、氧氟沙星、土霉素、氯霉素、庆大霉素和多粘菌素均敏感［8］；江苏分离到的菌株对氟苯尼考、环丙沙星高敏；对强力霉素、新霉素中敏；对磺胺间甲氧嘧啶、土霉素、罗红霉素低敏［9］；重庆西部分离到的菌株对头孢类药物、氨基糖苷类及黏杆菌素高敏；对四环素类、喹诺酮类、青霉素耐药［10］；韩国分离到的菌株对卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、新霉素河链霉素比较敏感［11］。可见不同地区分离的菌株对各种抗生素的敏感性不同，在用抗生素之前，应先进行药敏试验，根据结果选择敏感的药物。然而，用药物预防治疗疾病会使病菌产生耐药性，所以对美洲雁进行免疫接种，并加强养殖场的卫生消毒和疫病防护工作，是高效控制疾病的重要手段［12］。

［1］Sandhu.Riemerella anatipestifer infection［M］.Diseases of poultry，Blackwell Publishing Ltd，Oxford，UK，2008：758-764.

［2］Dennis R，Martin R，Klaus-Peter B，et al.Pathogenesis of Riemerella anatipestifer in turkeys after experimental mono-infection via respiratory routes or dual infection together with the avian metapneumovirus［J］.Avian Pathology，2009，38（6）：497-507.

［3］Zdenek Hubálek.An annotated checklist of pathogenic microorganisms associated with migratory birds［J］.Journal of Wildlife Diseases，2004，40（4）：639-659.

［4］Jortner B S，Leibovitz L.Central-Nervous-System Lesions of Spontaneous Pasteurella Anatipestifer Infection in Ducklings［J］. Avian Diseases，1969，13（1）：27-35.

［5］Leavitt S，Ayroud M.Riemerella anatipestifer infection of domestic ducklings［J］.Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne，1997，38（2）：113-113.

［7］Hu Q，Han X，Zhou X，et al.OmpA is a virulence factor of Riemerella anatipestifer［J］.Veterinary Microbiology，2011，150（3-4）：278-283.

［8］Subramaniam S，Huang B，Loh H，et al.Characterization of a predominant immunogenic outer membrane protein of Riemerella anatipestifer［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2000，7（2）：168-174.

［9］罗冬生，杨鹰.小鸭传染性浆膜炎的诊治.中国兽医杂志［J］. 1998，24（9）：23-24.

［10］胡方建，马云，徐凤书.一例鸭传染性浆膜炎的诊治［J］.山东畜牧兽医，2014，35.

［11］魏光河.渝西地区两株鸭疫里氏杆菌的分离鉴定与药敏试验［J］.中国兽医科学，2015，45（05）：481-485.

［12］Cha S Y，Seo H S，Wei B，et al.Surveillance and characterization of riemerella anatipestifer from wild birds in south korea［J］.Journal of Wildlife Diseases，2015，51.

［13］吕敏娜，张毓金，黄承锋.鸭疫里默菌病的研究进展［J］.广东畜牧兽医科技，2001，26：13-15.

Isolation，Identification and Antibiotic ResistanceStudy of Riemerela anatipestiferfrom American Wild Goose

CHEN Zhuo1，LUO Jing2，SU Wen2，ZHANG Guo-gang1，HE Hong-xuan2
（1.Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry Administration，National Bird Banding Center of China，The Research Institute of Forest Ecology，Environment and Protection，The Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，China；2.National Research Center for Wildlife Born Diseases，Key Laboratory of Animal Ecology and Conservation Biology，Institute of Zoology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China）

A pathogenic strain was isolated from the dead American Wild Goose in a farm in Beijing Miyun.According to the colonial morphology，gram strain，biochemical properties and PCR tests，the pathogen was identified as Riemerela anatipestifer.The results of drug resistance tests showed that the bacterium was highly sensitive to amoxicillin/clavulanic acid，cephalothin，cefotaxime，cefazolin，gentamicin，and ampicillin，moderatly sensitive to chloramphenicol，ciprofloxacin and amikacin，and resistant to kanamycin，tetracycline and trimethoprim/sulfamethoxazole.These results provide a theoretical basis for the rapid identification and the therapy of duck infectious serositis.

American Wild Goose；Riemerela anatipestifer；Isolation and identification；Drug resistance

s：HE Hong-xuan；ZHANG Guo-gang

S852.61+8

A

0529-6005（2016）04-0099-03

2015-09-09

林业公益性行业科研专项（201404404）；国家林业局野生动物疫源疫病项目专项；中国科学院战略生物资源科技支撑体系运行专项（CZBZX-1）；“十二五”国家科技支撑计划：野生动物跨境传播重要疫病监测与防控技术研究（2013BAD12B04）

陈卓（1991-），女，硕士生，研究方向为野生动植物保护与利用，E-mail：1053526368@qq.com

何宏轩，E-mail：hehx@ioz.ac.cn；张国钢，E-mail：zm7672@caf.ac.cn