红豆越橘酿酒优良降酸酵母的筛选及分离鉴定

杨 华，刘亚娜，郭德军

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319）

红豆越橘酿酒优良降酸酵母的筛选及分离鉴定

杨 华，刘亚娜，郭德军*

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319）

以红豆越橘果汁为原料，在24 ℃的恒温条件下自然发酵，从中筛选出一株优良的降酸菌株，对其进行分离鉴定，并研究其降酸性能。结果表明，菌株BY-9降酸性能最好，适合对红豆越橘果酒进行生物降酸处理。对菌株BY-9进行形态学和生理学特征鉴定以及内源转录间隔区（internally transcribed spacer，ITS）序列解析，鉴定出菌株BY-9为酵母属中的二孢结合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）。将菌株BY-9接入酒精发酵结束的红豆越橘果酒中，发现其使红豆越橘果酒总酸含量降低了12.26%。

红豆越橘；降酸酵母；筛选；分离；鉴定

酵母菌种的好坏直接影响果酒的品质，大部分营养丰富的浆果其酸度相对较高，以至于果酒酿成后依旧有较高的酸度，口感酸涩，严重影响果酒的品质。近年来国内外逐步兴起对果酒降酸方法的探索性研究，现今用于果酒降酸的方法主要有3 种：物理降酸法、化学降酸法、生物降酸法［1］。物理降酸法，所需时间长，酸度降低的幅度低；化学降酸法虽然见效快，效果明显，但是对果酒的品质损害较大，且物理降酸法和化学降酸法，主要是使果酒中的酒石酸含量降低，而对苹果酸的含量几乎无影响［2］；生物降酸法因降酸效果明显，对果酒品质无损害，近年来成为国内研究的热点。生物降酸主要有2 种代谢途径：苹果酸乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）和苹果酸酒精发酵（maloalcohol fermentation，MAF）。MLF降酸所要求的条件比较高，降酸能力有限；MAF降酸通常会有不良气味生成，影响果酒品质［3］。所以，近年来国内外都在探索更完善的生物降酸方法，并积极筛选优良的降酸菌种。研究发现，与果酒酿造相关的酵母涉及24 个属120多个种，有许多非酿酒酵母可以比酿酒酵母产生更多的酯类物质，增加果酒的香气［4-5］。某些非酿酒酵母还具有良好的降酸功效。赵玉平等［6］筛选出一株能降解柠檬酸的毕赤酵母（Pichia sp.）Y1；Delcourt等［7］发现酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）236对苹果酸具有良好的降解作用；Corte-Real等［8］研究发现汉逊酵母（Hansenula anomala），在一定条件下对L-苹果酸有一定降解作用。积极将非酿酒酵母利用到果酒发酵中，是未来果酒行业发展的趋势［9-10］。

红豆越橘果实是一种营养价值很高的天然野生浆果，主要产自我国的大兴安岭地区；富含多种具有生物活性的天然成分（如单宁、花色苷、黄酮、VC、VE等）；其具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗辐射、抗菌、明目、治疗糖尿病等多种功效［11-15］。红豆越橘浆果不仅有较高的营养价值，而且具有较高的经济价值［16-20］。我国的红豆越橘大部分被用于鲜食，加工成果汁及果干，红豆越橘资源没有得到较好的开发利用。利用红豆越橘酿造果酒是未来红豆越橘产品开发的一个方向，但至今鲜见利用红豆越橘酿酒的报道。红豆越橘果酒不仅可以提高红豆越橘的经济价值，丰富红豆越橘系列产品，更是为消费者提供了一种具有较高保健价值的饮品。但红豆越橘果汁酸度过大，导致酿造的红豆越橘果酒口感酸涩，这是利用红豆越橘酿酒过程中急需解决的问题。本实验在自然发酵的红豆越橘果酒中，筛选出一株具有优良降酸性能的菌株BY-9，以期为红豆越橘果酒的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与培养基

红豆越橘浆果由大兴安岭超越野生浆果加工有限公司提供，含糖量为53.15 g/L，含酸量为10.82 g/L（以苹果酸计），pH值为2.2；蔗糖购自大庆市九区批发市场。

硫酸铵、亚硫酸 生工生物工程（上海）股份有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）Premix、ITS Forward primer（20 pmol/μL）、ITS Reverse Primer（20 pmol/μL） 上海江莱生物科技有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（yeast peptone dextrose，YPD）液体培养基、YPD固体培养基 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

酵母菌鉴定生化管 上海江莱生物科技有限公司；DRP-9082型电热恒温培养箱 上海森信实验仪器有限公司；振荡器 上海高兴仪器设备有限公司；722可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；PCR扩增仪日本TaKaRa公司；核酸电泳仪 美国Advanced Biotech生物技术公司；电泳成像装置 英国Amersham Pharmacia Biotech公司；DNA测序仪 美国Applied Biosystem公司。

1.3 方法

1.3.1 红豆越橘果酒理化指标的测定方法

有机酸定量测定：采用GB/T 5009.157—2003《食品中有机酸的测定》方法进行。总酸含量测定：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用试验方法》电位滴定法。酒精体积分数测定：采用GB/T 15038—2006中蒸馏比重法。总糖含量测定：采用GB/T 15038—2006中斐林试剂滴定法。

1.3.2 红豆越橘果酒感官评定标准［21-22］

感官评定指标参考《葡萄酒工业手册》及GB/T 15038—2006，请10 位品评人员品尝红豆越橘果酒，并对色泽、香气、口味、风味进行打分，评分标准见表1。

1.3.3 红豆越橘果汁的预处理

挑选果形完整，无破损的红豆越橘浆果，进行破碎过滤处理。向得到的红豆越橘果汁中添加质量分数为0.03%～0.05%的硫酸铵，以保证酵母发酵有充足的氮源。并向果汁中添加0.80 mL/L的亚硫酸，放置于24 ℃的恒温条件下自然发酵。以发酵过程中总酸降低较多的红豆越橘酒醪为选育降酸菌株的菌源。取上述发酵液1 mL进行梯度稀释，取适量稀释梯度为10-3～10-4的发酵液均匀涂布于含体积分数为9%乙醇的YPD固体培养基上，28 ℃培养36 h，至少经过3 次划线分离，直至纯化。

1.3.4 降酸菌株的筛选

在含体积分数为9%乙醇的YPD液体培养基里，添加5 g/L的苹果酸，灭菌以后，接入上述分离纯化的菌株，活菌浓度需达到109CFU/mL以上。接种量为3%，28 ℃条件下培养3 d，以不接入菌株的培养液作空白对照，以苹果酸含量的降低为指标，筛选30 株具有明显降酸效果的菌株。选取3 株降苹果酸效果最好的菌株，接入酒精发酵结束后的红豆越橘果酒中，28 ℃发酵3 d，以降酸能力和感官评定为指标，选出1 株综合评价最好的降酸菌株。

1.3.5 降酸菌株的形态学观察

将分离纯化得到的具有明显降酸性能的菌株，通过划线的方法接种到YPD固体培养基上，28 ℃培养36 h，对其细胞形态和菌落特征进行观察。

1.3.6 降酸菌株的生理生化实验

参照朱佳娜等［23］的方法进行降酸菌株的糖发酵、同化碳源、同化氮源实验。将酵母菌接种到发酵糖类、同化碳源、同化氮源、分解尿素的酵母菌鉴定生化管中，观察其产气及生长反应情况。

1.3.7 降酸菌株的内源转录间隔区（internally transcribed spacer，ITS）序列解析鉴定

1.3.7.1 降酸菌株基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取

挑取菌体于50 µL PCR缓冲液（NO. 9164）中变性后离心，取上清液，得到菌株的基因组DNA。

1.3.7.2 ITS区的PCR扩增

以提取到的菌株基因组DNA为模板，使用ITS区的通用引物：ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），扩增引物的ITS区基因。

PCR反应条件为：预变性条件：94 ℃，5 min；变性条件：94 ℃，30 s；退火条件55 ℃，30 s；延伸条件：72 ℃，1 min；体系运行循环30 次，72 ℃延伸5 min，在4 ℃条件下进行保存。PCR反应体系：10×PCR buffer 5.0 µL、PCR premix 1 µL、ITS up primer（20 pmol/μL）0.5 µL、ITS down primer（20 pmol/µL）0.5 µL、ddH2O 23 µL，共50 µL。

1.3.7.3 ITS区的测定与分析

对得到的PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳处理，将含有目的片段的产物送到宝生物工程（大连）有限公司进行测序。将测得的ITS区序列在美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）进行BLAST分析，在GenBank核酸序列数据库中搜索同源序列，并进行比较分析，以鉴定菌株的种属。并利用MEGA Version 5软件构建菌株与相关种ITS区的系统发育树。

1.3.8 降酸菌株生长特性及耐受性能的确定［24］

1.3.8.1 降酸菌株最适生长温度的确定

将降酸菌株以3%的接种量接入100 mL YPD液体培养基内，分别在22、24、26、28、30、32 ℃条件下，培养24 h。通过测定其在660 nm波长处的吸光度确定降酸菌株的最适生长温度。

1.3.8.2 降酸菌株最适生长pH值的确定

将降酸菌株以3%的接种量接入100 mL YPD液体培养基内，培养基的pH值分别调整到2、3、4、5、6、7，在24 ℃的恒温条件下培养24 h。通过测定其在660 nm波长处的吸光度确定降酸菌株的最适生长pH值。

1.3.8.3 降酸菌株最适培养转速的确定

将降酸菌株以3%的接种量接入100 mL YPD液体培养基内，在24 ℃恒温水浴振荡器中，分别调节振荡器的转速为120、140、160、180、200、220 r/min，培养24 h。通过测定其在660 nm波长处的吸光度确定降酸菌株的最适培养转速。

1.3.8.4 降酸菌株酒精耐受性的测定

将降酸菌株以3%的接种量接入酒精体积分数分别为8%、11%、14%、17%、20%、23%的100 mL YPD液体培养基内，24 ℃恒温条件下培养24 h。通过测定其在660 nm波长处的吸光度确定降酸菌株的酒精耐受性。

1.3.8.5 降酸菌株渗透胁迫耐受性的测定

将活菌数量达到109CFU/mL以上的降酸菌株，以3%的接种量接入KCl质量分数分别为11%、12%、13%、14%、15%、16%的100 mL YPD液体培养基内，24 ℃恒温条件下培养24 h。通过测定其在660 nm波长处的吸光度确定降酸菌株的渗透胁迫耐受性。

1.3.8.6 降酸菌株SO2耐受性的测定

用亚硫酸调节YPD液体培养基，使培养基中SO2质量浓度分别达到100、150、200、250、300、350 mg/L。将降酸菌株以3%的接种量接入100 mL不同SO2含量的YPD液体培养基，24 ℃恒温条件下培养24 h。通过测定其在660 nm波长处的吸光度确定降酸菌株的SO2耐受性。

2 结果与分析

2.1 降酸菌株的筛选

选取30 株降苹果酸效果较好的菌株，将其编号为BY-1～BY-30［24］，降苹果酸效果最好的菌株编号分别为BY-7、BY-9、BY-21。将这3 株菌分别接入酒精发酵结束后，酒精体积分数为9.6%，总酸含量为10.1 g/L（以苹果酸计）的红豆越橘果酒中，28 ℃发酵4 d，以降酸能力和感官评定为指标，评价结果如表2所示。

由表2可知，与菌株BY-7和BY-21相比，接入菌株BY-9后的红豆越橘果酒，总酸含量较低，与没有进行降酸处理的红豆越橘果酒相比，菌株BY-9可使红豆越橘果酒的总酸降低12.87%，酒精体积分数有微量升高，残糖含量低，感官评定得分最高，色泽及口感最佳。所以综合考虑，选择菌株BY-9，作为红豆越橘果酒酒精发酵结束后优良的降酸菌株。

2.2 菌株BY-9的形态学特征

对菌株BY-9进行形态学观察其细胞和菌落形态，结果见图1。细胞形态为圆形或椭圆形细胞，不透明。菌落形态光滑湿润，突起，边缘整齐，质地松软黏稠，呈乳白色。菌株接入YPD液体培养基培养后，培养基变混浊，4 ℃条件下放置一段时间后，形成较厚实的白色沉淀。

2.3 菌株BY-9的生理生化实验结果

由表3可知，菌株BY-9能利用葡萄糖，而不能利用半乳糖、蔗糖、麦芽糖等糖源，这也说明利用菌株BY-9在红豆越橘果酒酒精发酵结束后进行降酸，菌株BY-9不会与酿酒酵母竞争利用蔗糖，不影响发酵进程。通过实验结果发现，菌株BY-9能同化的碳源：丙三醇、核糖醇、甘露醇，而不能同化淀粉、D-木糖、L-阿拉伯糖等碳源。菌株BY-9能同化的氮源有硫酸铵、乙胺，不能同化硝酸盐及尿素。

2.4 菌株BY-9的ITS的PCR扩增结果

由图2可知，对纯种菌株BY-9的基因组DNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果后，菌株BY-9 DNA的片段长度大约为800～900 bp。

2.5 菌株BY-9的ITS序列分析与系统发育树的建立

对菌株BY-9的ITS序列进行同源性分析，以确定菌株BY-9类型。将菌株BY-9的ITS序列输入GenBank，利用NCBI网站上的BLAST软件分析菌株BY-9与已发现菌株的相似度，并进行同源性比较，建立系统发育树（图3）。结果表明菌株BY-9与结合酵母属菌株有较好的同源性。结合菌株BY-9的形态学特征和生理生化实验结果，确定其为二孢结合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）。

2.6 菌株BY-9生长特性及耐受性能

由图4菌株BY-9生长特性的测定结果可得，菌株BY-9的最适生长温度为30 ℃，最适生长pH值为5.0，最适培养转速为180 r/min。

根据菌株BY-9耐受性的测定结果（图5），可得菌株BY-9对酒精的耐受体积分数为20%，然而果酒的体积分数一般不会高于20%，所以用菌株BY-9来降低果酒酸度，菌株的活性不会受到酒精的抑制，效果不受影响；菌株BY-9对于KCl的耐受质量分数为14%，耐渗透胁迫性较好；其对于SO2的耐受质量浓度是300 mg/L，相对于其他菌株［25］，菌株BY-9不但降酸效果好，对SO2的耐受性也比较强，果酒酿造的SO2添加量在140 mg/L左右，所以酿造过程中添加SO2，不会对菌株BY-9的活性起到抑制作用。

3 结 论

本实验筛选出一株对红豆越橘果酒具有明显降酸效果的酵母菌，通过形态学、生理生化、分子生物学实验对其种属进行鉴定，确定其为二孢结合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）。该菌适合用于红豆越橘果酒酒精发酵结束后的降酸，因为它不能利用蔗糖，不会与酿酒酵母竞争利用蔗糖，不影响发酵进程，可以使红豆越橘果酒的总酸含量降低12.26%。降酸酵母BY-9的最适生长温度为30 ℃、pH值为5.0、培养转速180 r/min，对酒精的耐受体积分数为20%，对于KCl的渗透胁迫耐受质量分数为14%，对SO2耐受质量浓度为300 mg/L。降酸酵母BY-9对于红豆越橘果酒有良好的降酸作用，丰富了用于果酒降酸的微生物种类，而降酸酵母BY-9的详细降酸机理，更是值得进一步研究的内容。

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Screening， Isolation and Identification of Acid-Degrading Yeast from Vaccinium vitis-idaea Wine

YANG Hua， LIU Yana， GUO Dejun*

（School of Food Science， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

A yeast strain with high acid-degrading ability from Vaccinium vitis-idaea juice fermented in a a thermostatically controlled incubator at 24 ℃ was isolated and identified. Its acid degradation capacity was investigated. The results indicated that strain BY-9， which had the highest acid-degrading capacity， was found to be the most suitable for reducing acidity of Vaccinium vitis-idaea wine. Based on morphological and physiological characterization， and internally transcribed spacer （ITS） analysis， strain BY-9 was identified as Zygosaccharomyces bisporus. The total acid content of Vaccinium vitis-idaea wine was reduced by 12.26% when BY-9 was inoculated after alcoholic fermentation.

Vaccinium vitis-idaea； acid-degrading yeast； selection； isolation； identification

10.7506/spkx1002-6630-201609033

Q815

A

1002-6630（2016）09-0175-06

杨华， 刘亚娜， 郭德军. 红豆越橘酿酒优良降酸酵母的筛选及分离鉴定［J］. 食品科学， 2016， 37（9）： 175-180. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609033. http：//www.spkx.net.cn

YANG Hua， LIU Yana， GUO Dejun. Screening， isolation and identification of acid-degrading yeast from Vaccinium vitisidaea wine［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 175-180. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609033. http：//www.spkx.net.cn

2015-07-02

黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目（YJSCX2014-Y45）；黑龙江省农垦总局科学技术开发课题（HNK13KF-15-01）

杨华（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物。E-mail：1157836297@qq.com

*通信作者：郭德军（1968—），男，教授，博士，研究方向为食品微生物。E-mail：187013609@qq.com