蒸汽爆破预处理对粉葛总黄酮及抗氧化性的影响

张 棋，易军鹏，*，李 欣，王新胜，李 冰，朱文学

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.河南科技大学化工与制药学院，河南 洛阳 471023）

蒸汽爆破预处理对粉葛总黄酮及抗氧化性的影响

张 棋1，易军鹏1，*，李 欣2，王新胜2，李 冰1，朱文学1

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.河南科技大学化工与制药学院，河南 洛阳 471023）

实验选取爆破压力1.0、2.0 MPa，维持压力时间30、40、60、80 s，对粉葛进行预处理。利用紫外分光光度法表征爆破前后总黄酮的变化，旨在探讨蒸汽爆破预处理对粉葛总黄酮及抗氧化性的影响。抗氧化活性利用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除率进行评价。结果表明：经过蒸汽爆破预处理后，粉葛的总黄酮提取量、甲醇提取物得率和抗氧化性得到显著提高。在最优处理条件下，总黄酮（以葛根素计）提取量达到5.43 mg/g，是未经预处理粉葛提取量的2.32 倍；甲醇提取物得率为16.92%；抗氧化活性得到显著增加，DPPH清除活性的半数抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50）由30.65 g/L降低至10.10 g/L。将蒸汽爆破预处理应用于粉葛活性物质的提取，可实现提取量和抗氧化能力的有效提高。

蒸汽爆破；粉葛；总黄酮；抗氧化性

粉葛（Puerariae thomsonii Radix）为豆科葛属藤本植物甘葛藤（Pueraria thomsonii Benth.）的干燥根，始载于《神农本草经》，是我国常用中药。粉葛自古与野葛同做葛根使用，现代研究发现粉葛与葛根（野葛）高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）指纹图谱存在较大差别［1］，2005版《中国药典》将粉葛与葛根分列记载。研究表明粉葛中的化学成分含有异黄酮、三萜类、淀粉及矿物元素等［2］。现代药理研究确认粉葛总黄酮为其主要药效成分，具有降低血压、抗氧化、抗癌等作用。葛根素则可以清除自由基、抗脂质过氧化［3-4］。因此，粉葛受到了制药行业、食品行业，尤其是保健品行业的关注。

粉葛总黄酮的提取有传统提取方法如醇回流提取法，提取新技术如超声提取［5］、微波辅助提取［6］等。本课题组前期研究表明［7］，总黄酮提取量达到相近水平时，热回流提取所需的时间远远长于超声或微波辅助提取所需的时间。但这些提取新技术因为操作复杂、高成本等原因限制了其工业化的应用。

蒸汽爆破技术是将样品在高温、高压条件下处理，使高温饱和蒸汽快速渗透到植物细胞中，并通过瞬间泄压，将热能转化为机械能，同时发生类酸性水解，使植物组织的细胞破裂、结构破坏，以便于后续的加工、处理，是一种物理化学预处理手段［8-9］。

蒸汽爆破技术，起初应用于人造纤维板的生产，后来多用于秸秆等木质纤维素原料的预处理、动物饲料加工［10-11］，进而推广到烟草加工、中草药提取、油脂提取、羽毛角蛋白提取等行业领域［12-15］。付小果等［16］在研究直接固态同步糖化发酵乙醇，提取发酵剩余物中葛根黄酮时，将蒸汽爆破技术应用于葛根处理。但仍未见有对粉葛蒸汽爆破处理后，研究其活性成分及抗氧化活性变化的报道。本实验探讨了蒸汽爆破预处理对粉葛总黄酮以及抗氧化活性的影响，对蒸汽爆破技术在促进药食两用资源的高值化利用，具有重要的理论和现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粉葛购自郑州瑞龙制药股份有限公司，经新乡医学院药学院药用与生药学教研室吴艳芳副教授鉴定为甘葛藤（Pueraria thomsonii Benth.）的干燥根。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美国Sigma公司；葛根素（批号110752-201313，纯度95.5%） 中国食品药品检定研究院；5-羟甲基糠醛（批号S27M6G2，纯度98%）上海源叶生物生物科技有限公司；糠醛（纯度99.5%）天津光复精细化工研究所；甲醇、无水乙醇（分析纯）天津德恩化学试剂厂；乙腈（色谱级） 西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

QBS-80型蒸汽爆破机 鹤壁正道生物能源有限公司；SHZ-D（III）循环水真空泵 郑州长城科工贸有限公司；RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；UV-2400紫外-可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；FA1004型分析天平 上海上平仪器有限公司；JSM-5610LV 扫描电子显微镜 日本电子株式会社；1260高效液相色谱仪 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 粉葛蒸汽爆破预处理

将干燥的粉葛用蒸馏水预浸泡5 h，一部分放入蒸汽爆破机物料仓中，通入饱和蒸汽，压力选取1.0、2.0 MPa，维压时间选取30、40、60、80 s，在极短的时间内（0.087 5 s）［10］完成泄压，实现蒸汽爆破；另一部分为空白对照。将处理后的样品收集，40 ℃真空干燥，粉碎过60 目筛，置于避光通风处，待分析。

1.3.2 粉葛微观结构观察

将干燥的粉葛样品用导电胶带黏到样品台上，使用离子溅射技术对表面进行喷金处理，用扫描电子显微镜观察蒸汽爆破预处理对粉葛微观结构的影响。

1.3.3 总黄酮物质的提取

1.3.3.1 最大吸收波长的选择

取葛根素、糠醛、5-羟甲基糠醛标准溶液和适宜质量浓度样品提取液，于220～450 nm波长范围内扫描，波长间隔为1 nm。

1.3.3.2 葛根素标准曲线的绘制

精密称取葛根素标准品4.3 mg，甲醇溶解并定容至100 mL，得到质量浓度为43 µg/mL的葛根素标准液。吸取葛根素标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于10 mL比色管中，各加甲醇溶液1.0 mL，加去离子水稀释至刻度，摇匀，测定250 nm波长处吸光度。以吸光度值为纵坐标，葛根素质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.014 5x+0.003 7（R2=0.999 7）。

1.3.3.3 总黄酮的提取

准确称取爆破粉葛与对照组粉葛各2.0 g，分别置于100 mL锥形瓶中，加入70%甲醇40 mL，65 ℃回流提取1 h，抽滤得提取液。残渣按上述方法重复提取1 次，合并2 次滤液，减压浓缩至浸膏，甲醇定容至50 mL，作为提取液。取40 mL提取液，减压浓缩，真空冷冻干燥，计算甲醇提取物的得率，计算公式如下。

式中：m为40 mL提取液冻干后的质量/g；m0为提取时所用粉葛的质量/g。

剩余提取液用于测定DPPH自由基清除能力和总黄酮提取量。取0.2 mL样品液于10 mL比色管中，加甲醇1.0 mL，去离子水稀释至刻度，摇匀，在250 nm波长处测定吸光度，根据葛根素标准曲线计算总黄酮提取量，结果以葛根素当量表示（mg葛根素/g）。

1.3.4 粉葛甲醇提取液中糠醛、5-羟甲基糠醛含量的测定

采用HPLC外标法定量测定待测样品液中糠醛与5-羟甲基糠醛含量。

HPLC色谱条件：ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；流动相：乙腈-0.1%乙酸水溶液（15∶85，V/V）；检测波长：278、284 nm。

1.3.5 粉葛提取液对DPPH自由基清除作用

按照Ye Chunli等［17］的方法做适当修改：分别吸取2 mL 质量浓度分别为8、16、24、32、40 g/L的提取液，2 mL，70%甲醇与1 mL，0.5 mmol/L新鲜配制的DPPH无水乙醇溶液于比色管中，混匀，暗处放置30 min，于517 nm波长处测定吸光度A。样品对照组（Ab）用无水乙醇代替DPPH无水乙醇溶液，用70%甲醇代替样品提取液作为模型对照组（A0）。并按下式计算DPPH自由基清除率。

1.4 数据统计分析

所有实验重复3 次，用DPS 9.50数据处理软件，对实验结果进行单因素试验统计分析。

2 结果与分析

2.1 蒸汽爆破预处理对粉葛微观结构的影响

对未爆破粉葛进行喷金处理时，由于粉葛富含淀粉且粒径较大，易洒落，导致粉葛导电性不均匀，但整体不影响微观结构的观察。由图1a可知，粉葛表面被淀粉颗粒覆盖，细胞排列整齐，无纤维外露现象，不见裂缝与细胞间隙的存在。蒸汽爆破处理后粉葛（图1b、1c）质地紧实，淀粉颗粒减少，这一现象可能是由于淀粉在高温、高压条件下发生分解，淀粉分子聚合度减小，大分子的晶格被破坏。同时，粉葛表面出现裂缝，细胞间产生间隙，致密的纤维结构被打乱而变得蓬松、卷曲，出现裸露的纤维束。这一现象可能是由于蒸汽爆破在泄压过程，渗透到细胞内及组织间的水蒸气膨胀，并且高速瞬间释放出来，巨大剪切力的存在使纤维发生机械断裂，细胞结构发生破坏。Chen Guozhong等［14，18］在研究蒸汽爆破对漆树果的影响时，发现蒸汽爆破处理后漆树果内、外果皮结构发生改变，出现裂缝、断裂与空洞，与本实验得到的结论一致。

2.2 最大吸收波长的确定

由图2可知，葛根素、糠醛、5-羟甲基糠醛的最大吸收波长分别为250、278、284 nm，未经过蒸汽爆破处理的粉葛提取液在250 nm处有一个明显的吸收峰， 经蒸汽爆破处理的粉葛提取液同样在250 nm处出现最大吸收峰。由于糠醛和5-羟甲基糠醛在250 nm有微弱的吸收，因此对葛根异黄酮提取液进行HPLC分析，检测是否有糠醛和5-羟甲基糠醛，以及对两者的含量进行测定。

经HPLC分析，粉葛原样以及蒸汽爆破样品的提取液中均未检测到糠醛，同时粉葛原样提取液中未检测到5-羟甲基糠醛，蒸汽爆破样品提取液中检测到5-羟甲基糠醛的存在。绘制峰面积与样品质量浓度标准曲线，经过定量计算发现蒸汽爆破样品提取液中5-羟甲基糠醛含量随蒸汽爆破强度的增加而提高，且含量范围为0.055～0.129 mg/g。按照粉葛醇提液中总异黄酮吸光度的测定方法，在250 nm波长处测定5-羟甲基糠醛的吸光度值，并绘制样品质量浓度与吸光度的标准曲线，得到粉葛醇提液中5-羟甲基糠醛所产生的吸光度值在0.003 5～0.007 7，而蒸汽爆破粉葛醇提液的吸光度范围在0.4～0.7之间，误差小于5%，故糠醛、5-羟甲基糠醛在250 nm波长处对吸光度所产生的影响可以忽略。根据以上分析，说明选择波长250 nm作为检测葛根素和葛根异黄酮总量具有一定的专属性和适用性。

2.3 蒸汽爆破预处理对总黄酮提取量以及甲醇提取物得率的影响

由图3a可知，与未处理的粉葛相比，蒸汽爆破预处理之后总黄酮提取量显著增加。黄酮成分大部分被包裹在细胞壁中［19］，预处理之后，粉葛内部结构断裂，结构变得疏松，比表面积增大，抗提取屏障被打破，有利于活性物质的溶出和分离提取。而且在较低压力条件下（1.0 MPa），随着维压时间的延长，总黄酮提取量增加。渗透到细胞间的蒸汽越多，作用时间越长，对粉葛完整结构的破坏作用越大，结构越疏松，细胞内部结合的黄酮释放的越完全。在2.0 MPa处理条件下，维压时间的持续增加，并没有使黄酮提取量逐渐增加，反而出现先增加后降低，这一结果与张兵兵等［20］对蒸汽爆破提取银杏叶黄酮的工艺优化研究得到的结果一致。这表明在较高压力条件下，短时间内细胞内的不溶性的黄酮转化的不够完全，提取量逐渐升高，且增加的速率较大。维压时间过长则出现下降，这一现象可能是在高压高温条件下过长的维压时间导致黄酮发生降解，且细胞内部溶出的黄酮又重新聚合形成不溶性物质所引起的［21］。周丽等［22］在对葛根中总异黄酮进行亚临界提取时，同样发现高温使葛根的部分成分降解，使多糖、蛋白质等非提取成分浸出，包裹在原料表面，导致黄酮不能充分提取。

未经过蒸汽爆破处理过的粉葛总黄酮提取量为2.34 mg葛根素/g，在1.0 MPa、80 s处理下，总黄酮提取量达到4.87 mg葛根素/g，在2.0 MPa、60 s条件下，总黄酮提取量达到达到5.43 mg葛根素/g，分别是未处理粉葛总黄酮提取量的2.08 倍和2.32 倍。但是当爆破条件达到2.0 MPa、80 s时，总黄酮提取量出现下降趋势，尽管如此，仍是未经过处理粉葛总黄酮提取量的2.21 倍。在相同的维压时间下，在2.0 MPa条件下总黄酮提取量高于1.0 MPa，推测这是由于饱和蒸汽压力越高，产生的机械作用越大，粉葛的完整结构受到更严重的破坏，传质阻力减小，更有利于物质的提取，这与Chen Guozhong等［18］在研究漆树果蒸汽爆破预处理后，提取黄酮时得到的研究结论相符。

由图3b可知，随着压强的增大、维压时间的延长，甲醇提取物的得率逐渐增加，在1.0 MPa、80 s，2.0 MPa、80 s处理条件下，甲醇提取物得率分别达到15.12%、16.92%，而未经过蒸汽爆破处理样品的提取物得率仅为10.94%。甲醇提取物得率显著增加，这可能是由于粉葛中大量纤维素、半纤维素的存在，蒸汽爆破引起纤维素的不定型区发生水解，木糖降解成糠醛，葡萄糖降解成5-羟甲基糠醛［23］，均可溶于甲醇；另外，蒸汽爆破处理时，木质素分解生成的酚酸类物质，在甲醇中溶解性也会增加［24-26］。总之，物理结构发生改变，传质阻力减小，黄酮等活性成分被有效释放，以及纤维素、木质素的降解，引起溶解性增大而引起的，龚凌霄［27］在对青稞麸皮研究的实验中得到了同样的结论。

2.4 蒸汽爆破对甲醇提取液抗氧化能力的影响

对不同爆破条件下提取液的抗氧化能力采用DPPH自由基清除法对比。由图4可知，经过预处理后，提取液的抗氧化能力显著增加。处理条件为2.0 MPa、60 s时，粉葛总黄酮的提取量出现下降，但是粉葛醇提液的抗氧化活性却没有降低。随着提取液质量浓度的增加，抗氧化能力增大的趋势开始减缓，此条件下IC50为10.10 g/L，远远低于未处理粉葛的IC50（30.65 g/L）。出现这一现象可能是，由于粉葛中木质素含量约为9.05%，蒸汽爆破处理之后木质素会部分降解为低分子酚类物质［26］，这在一定程度上有助于抗氧化能力的提高。同时，粉葛中淀粉含量较多，在本课题组未发表的研究中已经证明，蒸汽爆破处理后水溶性总糖的含量增加，多糖热分解产生5-羟甲基糠醛等，也会有助于抗氧化能力的提高。在Noda等［28］的研究中同样证明，蒸汽爆破之后物料的抗氧化性增加是由于黄酮类物质的增加，以及其他物质的降解所引起的。

3 结 论

将蒸汽爆破预处理应用到粉葛总黄酮的提取过程中，随着蒸汽压强的增加和维压时间的延长，总黄酮提取量、甲醇提取物得率和抗氧化活性在一定程度上会有所提高，这是因为蒸汽爆破预处理可以减弱粉葛细胞壁的阻碍作用，致使比表面积增大、传质阻力减小、溶剂渗透加快，促进了活性成分的提取。同时，高温、高压对不稳定化学键（如糖苷键）的破坏，导致预处理过程中发生化学变化，细胞内结合态的黄酮转化为游离态，且木质素、纤维素类物质发生降解，也对上述结果起到了促进作用。根据本实验结果可知，在合适的处理条件下蒸汽爆破有利于总黄酮的提取和抗氧化性的增强，同时剧烈的预处理导致黄酮类物质分解，阻碍了提取量的增加。在本实验中，总黄酮的提取量比对照组增加了0.39～1.32 倍，抗氧化活性明显增强，压力与维压时间对各项指标的影响均为极显著（P＜0.01）。

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Effect of Steam Explosion on Total Isoflavone Content and Antioxidant Capacity of Puerariae thomsonii Radix

ZHANG Qi1， YI Junpeng1，*， LI Xin2， WANG Xinsheng2， LI Bing1， ZHU Wenxue1
（1. College of Food and Bioengineering， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023， China；2. College of Chemical Engineering and Pharmacy， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023， China）

Steam explosion pretreatment was employed on Puerariae thomsonii Radix at a steam pressure of 1.0 and 2.0 MPa for 30， 40， 60 and 80 s， respectively. In order to explore the effect of steam explosion pretreatment on the total isoflavone content and antioxidant capacity of Puerariae thomsonii Radix， the content of total isoflavones was determined using UV spectrophotometry. The 1， 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radical scavenging activity was used to evaluate free radical scavenging capacity. The results indicated that the extraction efficiency of total isoflavones， the yield of methanol extract and antioxidant capacity significantly increased after steam explosion. Under optimal conditions， the yield of total isoflavones （calculated as puerarin） was 5.43 mg/g， which was 2.32 times as much as that of the untreated sample； the yield of methanol extract was 16.92%， and the 50% inhibitory concentration （IC50） for DPPH radical scavenging activity decreased from 30.65 g/L to 10.10 g/L， suggesting that the antioxidant capacity was improved. It can be concluded that a proper and reasonable steam explosion pretreatment can be applied to extract the active compounds and enhance the antioxidant capacity of Puerariae thomsonii Radix.

steam explosion； Puerariae thomsonii Radix； total isoflavones； antioxidant capacity

10.7506/spkx1002-6630-201609008

TS202.3

A

1002-6630（2016）09-0040-05

张棋， 易军鹏， 李欣， 等. 蒸汽爆破预处理对粉葛总黄酮及抗氧化性的影响［J］. 食品科学， 2016， 37（9）： 40-44. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609008. http：//www.spkx.net.cn

ZHANG Qi， YI Junpeng， LI Xin， et al. Effect of steam explosion on total isoflavone content and antioxidant capacity of Puerariae thomsonii Radix［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 40-44. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609008. http：//www.spkx.net.cn

2015-06-05

国家自然科学基金面上项目（31271972）；河南科技大学博士科研基金资助项目（400813480035）

张棋（1990—），女，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail：zhang2014qi@126.com

*通信作者：易军鹏（1976—），男，副教授，博士，研究方向为药食两用生物资源高值化利用。E-mail：yijunpeng@126.com