miR-93真核表达载体的构建及其表达验证

黄　军，吴开杰，惠　珂，王　彬，王新阳，贺大林

(西安交通大学第一附属医院泌尿外科，陕西西安　710061)



·基础研究·

miR-93真核表达载体的构建及其表达验证

黄军，吴开杰，惠珂，王彬，王新阳，贺大林

(西安交通大学第一附属医院泌尿外科，陕西西安710061)

目的构建人miR-93真核表达载体，并验证其表达效果，为进一步研究miR-93的生物学功能提供有利工具。方法用PCR方法从293T细胞基因组DNA中扩增miR-93前体序列，引物引入酶切位点和保护碱基，产物用限制性内切酶EcoRⅠ和BglⅡ双酶切后插入pEZX-MR04表达载体中，构建miR-93真核表达载体pEZX-MR04-miR-93。构建好的载体用双酶切、PCR和测序鉴定，同时转染293T细胞，用Real time PCR检测重组pEZX-MR04-miR-93质粒的miR-93表达效率。结果成功构建miR-93真核表达载体pEZX-MR04-miR-93，重组pEZX-MR04-miR-93质粒转染293T细胞后miR-93表达上升约21倍。结论构建的miR-93真核表达载体pEZX-MR04-miR-93可显著上调细胞中miR-93水平，为进一步研究miR-93在泌尿系肿瘤中的生物学功能提供可靠工具，奠定了坚实的实验基础。

miR-93；表达载体；pEZX-MR04；293T

微小RNA(microRNA，miR)是一类广泛存在于生物体内的长度约为19～25个碱基的单链非编码RNA，自被发现以来，数以千计的microRNA相继被报道并研究。越来越多的研究证实，microRNA可广泛参与生物体的各项生物学行为，包括肿瘤的进展、生物体的发育、心脑血管疾病、骨关节炎等。人miR-93由7号染色体编码，自2008年被首次报道参与T细胞白血病进展起[1]，miR-93在多种疾病如川崎病[2]、心肌缺血再灌注[3]、肥胖[4]、肿瘤、脑创伤[5]、糖尿病[6]等中相继被报道。尤其在肿瘤中miR-93发挥着不同的作用。在结直肠癌患者标本中，miR-93的表达明显高于复发患者，体外实验证实miR-93可抑制结肠癌细胞的增殖和迁移，并下调细胞周期蛋白B1(cyclin B1， CCNB1)、ERBB2、p21和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)等的表达[7]。而在胃癌[8]、鼻咽癌[9]、肝癌[10]、乳腺癌[11]、肺癌[12]等肿瘤中，miR-93可通过靶向调控PDCD4、转化生长因子β受体2，(transforming growth factor beta receptor 2，TGFβR2)、PTEN、周期依赖性激酶抑制剂1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A)、转录因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2， NRF2)、DAB2等进而促进肿瘤的进展。可见，miR-93在不同的疾病中扮演着不同的角色，但其在泌尿系肿瘤中的作用尚不明确。因此，进一步的深入研究miR-93在泌尿系肿瘤发生、发展的作用及其机制显得尤为重要。本研究旨在构建人miR-93的真核表达载体，并验证其表达效率，以期为后续深入研究miR-93提供稳定而有利的工具，奠定后续研究的基础。

1　材料与方法

1.1材料pEZX-MR04对照质粒(pEZX-MR04-miR-con)购自美国GeneCopoeia公司，DH5α感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司，293T细胞由本实验室保存，培养于含10%胎牛血清的达尔伯克必需基本培养基(DMEM)中，置于37℃含5%CO2的培养箱中培养。X-TremeGENE HP DNA Transfection Reagent购自Roche公司。基因组DNA提取试剂盒、高保真DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司，胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自OMEGA公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，miScript II RT Kit和miR-93实时定量PCR引物购自QIAGEN。

1.2实验方法

1.2.1引物合成从“miRBase”、NCBI和“Ensemble”分别获取miR-93成熟体序列、Pre-miR-93序列及其两侧约100 nt的侧翼序列，依据该序列由Primer-BLAST设计PCR引物，引入酶切位点EcoRⅠ、BglⅡ和保护碱基，同时合成pEZX-MR04上下游测序引物。引物由苏州金唯智公司合成。Pri-miR-93 forward primer: 5′-GAAGATCTACCTTCACTGAGAGGGTGGT-3′，Pri-miR-93 reverse primer: 5′-CGGAATTCACCAGACCCTTTTGAACGCC-3′，测序引物序列由GeneCopoeia公司提供，pEZX-MR04 forward primer:5′-CCGACAACCACTACCTGA-3′，pEZX-MR04 reverse primer: 5′-ATTGTGGATGAATACTGCC-3′。

1.2.2重组质粒的构建与鉴定从293T细胞提取基因组DNA，利用Pri-miR-93 forward primer和Pri-miR-93 reverse primer引物扩增目的基因片段，反应条件为：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 20 s；共30个循环。之后用3%琼脂糖凝胶电泳，将含288 bp目的片段的胶回收后用EcoRⅠ和BglⅡ进行双酶切。pEZX-MR04对照质粒用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切后回收线性化空载体。将目的片段和线性化空载体于16℃连接过夜后转化DH5α感受态细胞，涂布于含Amp的LB培养皿上，置于37 ℃培养过夜。随机挑取10个菌落于LB液体培养基中37 ℃摇菌过夜，抽提质粒后用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切鉴定，并利用pEZX-MR04 forward primer和pEZX-MR04 reverse primer进行PCR扩增片段电泳鉴定。对上述步骤鉴定正确的克隆进一步测序鉴定。

1.2.3293T细胞瞬时转染转染前一天，将3×105293T细胞接种于6孔板，当细胞汇合度达70%时用X-TremeGENE HP DNA Transfection Reagent进行质粒转染，pEZX-MR04对照质粒作为阴性对照。培养48 h后，用TRIzol提取总RNA，用miScript II RT Kit对包含microRNA的总RNA进行逆转录及实时定量PCR，实时定量PCR反应条件为：95 ℃ 30 s，后进入30个循环重复(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)。U6作为内参引物。

2　结　果

2.1基因组中对应miR-93的目的基因片段PCR扩增PCR扩增产物用3%琼脂糖凝胶电泳，在约300 bp处可见一特异性扩增条带，与预测值大小相符(图1)。

图1　基因组中对应miR-93的目的基因片段PCR扩增产物鉴定

Marker：DNA marker (50 bp DNA 标记)；1：基因组中对应miR-93的目的基因片段PCR扩增产物(288 bp)

2.2重组质粒pEZX-MR04-miR-93的双酶切鉴定重组质粒pEZX-MR04-miR-93用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切后，用3%琼脂糖凝胶电泳，双酶切产物在288 bp处可见一特异性条带，与预期相符(图2)。同时未酶切pEZX-MR04-miR-93质粒可见超螺旋结构、线性结构和环形结构显影，pEZX-MR04-miR-93质粒双酶切产物在未酶切产物超螺旋结构和环形结构间可见一特异性条带，与预期相符。

2.3重组质粒pEZX-MR04-miR-93的PCR鉴定分别取1 ng重组质粒pEZX-MR04-miR-93和pEZX-MR04-miR-con做模板，用pEZX-MR04 forward primer和pEZX-MR04 reverse primer进行PCR扩增，反应条件：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s；30个循环。PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳鉴定，pEZX-MR04-miR-con PCR产物在612 bp处有一条带，在pEZX-MR04-miR-93 PCR产物在676 bp处有一条带，与预期大小相符(图3)。

图2　重组质粒pEZX-MR04-miR-93的双酶切鉴定

Marker：DNA marker (50 bp DNA 标记)；DC：双酶切(Double Cutting)；UC：未酶切(Un-Cutting)

图3　重组质粒pEZX-MR04-miR-93 PCR鉴定

Marker：DNA marker (50 bp DNA 标记)；1：pEZX-MR04-miR-93 PCR产物；2：pEZX-MR04-miR-con PCR产物

2.4重组质粒pEZX-MR04-miR-93的测序鉴定提取重组质粒送北京奥科公司测序，结果显示目的基因序列成功克隆至pEZX-MR04表达载体中，miR-93真核表达载体pEZX-MR04-miR-93构建成功。

2.5细胞转染和Real Time q-PCR验证将pEZX-MR04-miR-con和构建好的pEZX-MR04-miR-93质粒分别转染293T细胞，24 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)。在转染了pEZX-MR04-miR-93质粒的293T细胞中可见GFP表达(图4)。48 h后提取总RNA进行逆转录，Real time q-PCR验证miR-93表达差异。结果显示293T细胞转染pEZX-MR04-miR-93质粒组其miR-93表达量较pEZX-MR04-miR-con质粒组高约21倍(图5)，证实重组pEZX-MR04-miR-93质粒可高效表达miR-93。

图4　荧光显微镜下观察转染了pEZX-MR04-miR-93质粒的293T细胞

图5　Real time q-PCR检测转染后48 h 293T细胞中miR-93表达差异(***P<0.001)

3　讨　论

microRNA是一类内源性的小分子单链非编码RNA，广泛存在于多种生物体内，即便在同一生物体内，其表达也存在组织和器官特异性。microRNA大小仅19～15碱基，但却可通过与其靶基因mRNA的3′非翻译区(3′-untranslated region, 3′-UTR)互补配对促进mRNA的降解或抑制其翻译，从而发挥其功能，参与生物体的各种进化过程。

miR-93广泛参与人类疾病进程，其表达随疾病不同而异。在复发性结直肠癌患者标本中，miR-93表达显著低于无复发患者。在卵巢上皮癌患者标本中，其表达亦低于正常妇女卵巢组织[13-14]。而在胃癌、食管癌、胶质瘤等肿瘤中，其表达均上调。除肿瘤外，异常表达的miR-93尚与冠状动脉粥样硬化[15]、川崎病、肥胖、糖尿病等多种疾病进展相关。在经典的信号通路调控中，miR-93亦扮演重要角色。例如在肺癌中，miR-93/ZNRF3/Wnt/β-catenin信号通路可促进肿瘤细胞的生长[16]；而在结直肠癌中，miR-93/Smad7/Wnt/β-catenin信号通路则可抑制肿瘤细胞的侵袭、迁移及增殖[17]；在肝癌和胶质瘤的研究中，miR-93被证实可激活PI3K/Akt信号通路，进而促进肿瘤的进展[18]。可见miR-93在不同的疾病进展中起着不同的作用，其错综复杂的关系网、众多的靶基因及不同的信号通路尚需做进一步的深入研究。

本研究成功构建了人miR-93真核表达载体pEZX-MR04-miR-93，该载体可在细胞水平显著上调miR-93表达水平。重组pEZX-MR04-miR-93质粒带有绿色荧光蛋白标签，可在荧光显微镜下直接监测细胞转染效率，同时，载体带有嘌呤霉素抗性基因，可用于稳定表达克隆的筛选，可为后续体内外实验提供稳定而可靠的模型。综上，本实验构建的人miR-93真核表达载体pEZX-MR04-miR-93可为后续进一步研究miR-93在泌尿系肿瘤中的作用、机制提供方便而稳定的工具。

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(编辑王玮)

The construction and expression verification of miR-93 eukaryotic expression vector

HUANG Jun, WU Kai-jie, HUI Ke, WANG Bin, WANG Xin-yang, HE Da-lin

(Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

ObjectiveTo construct a eukaryotic expression vector of human miR-93 and test its expression efficiency, in order to offer a good tool to further study the biological functions of miR-93. Methods PCR was used to amplify the precursor sequence of human miR-93 from the genomic DNA of 293T cells, which were then cloned into the pEZX-MR04 expression vector to produce the recombinant pEZX-MR04-miR-93 plasmid. Enzyme double digestion, PCR and sequence analysis were adopted to verify the recombinant pEZX-MR04-miR-93 plasmid. After that, 293T cells were transfected with the recombinant pEZX-MR04-miR-93 plasmid and real time PCR was used to test its expression efficiency of miR-93. Results The eukaryotic expression vector of miR-93 was successfully constructed. After transfection with the recombinant pEZX-MR04-miR-93 plasmid, the expression level of miR-93 in 293T cells could be up-regulated by 21 folds. ConclusionThe recombinant pEZX-MR04-miR-93 expression vector was successfully constructed and could significantly increase miR-93 level in cells, which will offer us a convenient tool to further study the biological functions of miR-93.

miR-93; expression vector; pEZX-MR04; 293T

2016-05-24

2016-06-18

国家自然科学基金(No.81572516)、陕西省国际科技合作与交流计划项目(No.2016KW-021)

贺大林，教授.E-mail: held@mail.xjtu.edu.cn

黄军(1990-)，男(汉族)，博士研究生在读.研究方向：microRNA在泌尿系肿瘤恶性进展中的作用及机制研究.

E-mail: 846969656@qq.com

R331

ADOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.10.016