烟草品种青枯病抗性的组培苗接种鉴定方法研究

徐　进，许景升，张　昊，冯　洁，顾　钢

（1.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；2.福建省烟草农业科学研究所，福州 350003）

烟草品种青枯病抗性的组培苗接种鉴定方法研究

徐进1，许景升1，张昊1，冯洁1，顾钢2*

（1.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；2.福建省烟草农业科学研究所，福州 350003）

由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病是制约我国烟草产业发展的瓶颈之一。选育抗病品种是防控该病最经济有效的策略。为探寻快速评价烟草品种青枯病抗性的方法，以6个抗感水平差异显著的烟草品种试管苗为研究对象，采用浸根接种法，评价了室内快速鉴定方法的可行性。结果显示，以浓度为3×106cfu/mL的青枯菌体悬液接种21 d后，红花大金元、翠碧1号、云烟85、K326、G80和岩烟97的病情指数分别为100.0、90.5、88.8、86.6、56.0和53.8，各品种试管苗的病情指数与田间自然发病情况呈明显正相关性，相关系数为0.936，达极显著水平。由此可见，室内无菌苗接种法能正确反映出不同烟草品种对青枯病的抗性水平，可作为快速、可靠评价烟草品种抗性水平的初筛手段。

烟草品种；青枯病抗性；试管苗

植物细菌性青枯病（Bacterial wilt of plants），是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al.，简称青枯菌）引起的一种世界性重大病害[1]。由青枯菌1号小种引起的烟草青枯病，于1880年在美国北卡罗莱纳那州的格兰维尔首次被报道，因此其又被称为格兰维尔萎蔫病（Granville wilt）[2]。烟草青枯病在我国南方烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、四川、贵州及广西危害最为严重，2008年全国烟草行业因青枯菌1号小种造成的烤烟产值损失高达1.15亿元[3]。

由于青枯菌特别是其1号小种寄主范围广泛，菌系变异类型较多，侵染来源复杂，且迄今为止尚无经济有效的化学农药可用于防治，因此青枯病被公认是一种难以控制的土传细菌病害[4]。

选育抗病品种是防控青枯病最为经济有效的措施。传统烟草品种的青枯病抗性鉴定方法包括：网室接种、人工病圃和大田自然病圃法。福建烟区也一直沿用传统的田间人工病圃灌根法进行烟草品种抗性鉴定，该方法虽在青枯病抗性资源鉴定评价和新品种选育方面卓有成效，但鉴定周期较长，通常需要花费整个生产季节，增加了资源评价成本，降低了品种选育效率。

国外相关研究以无菌组培苗为受体材料，分别成功地评价了不同香蕉品种对黄单胞菌萎蔫病（Xanthomonas campestris pv. musacearum）、黑条叶斑病（Mycosphaerella fijiensis Morelet）和巴拿马病（Fusarium oxysporum f. sp. cu-bense (Foc)）的抗性水平，并揭示出该评价方法与田间评价获得的结果具有显著的相关性[5-7]。

迄今为止，国内外尚无利用烟草组培苗接种法作为烟草青枯病品种抗性快速评价的相关报道。本研究旨在探寻组培苗接种法用于评价烟草品种青枯病抗性水平的可行性，并探究其与大田筛选鉴定结果的相关性，以期建立简捷可靠、高通量的室内烟草品种青枯病抗性评价体系。

1　材料与方法

1.1供试菌株材料

分别挑取室温条件下保存于灭菌去离子水中的各青枯菌株材料（表1），于TZC培养平板上划线，30 ℃条件下培养48 h后，挑取典型的青枯菌野生型菌落，经PCR验证阳性后，转至普通NA培养平板，30 ℃条件下培养48 h。

采用比浊法，挑取各纯培养物，分别于灭菌去离子水中配置成浓度为3×108cfu/mL的细菌悬浮液；分别取各菌体悬浮液30 mL，采用伤根法接种单株4～6叶龄的福建烟区主栽高感品种红花大金元盆栽苗，观察各菌株致病情况。并根据发病结果，选定接种表现强毒力的青枯菌株作为随后抗性筛选评价的接种体材料。

1.2供试植物材料

分别将供试烟草品种红花大金元、K326、岩烟97、G80、云烟85和翠碧1号种子置于70%的乙醇溶液中浸泡30 s后，用灭菌去离子水漂洗2次，每次5 min；随后浸泡于有效氯含量为5%的NaClO水溶液中，轻柔振荡3 min。最后用灭菌去离子水振荡漂洗3次，时间分别为5、15和40 min。将吸干表面水分后的种子转移至1/2 MS培养基上，置于光照培养室内培养。培养条件为25 ℃，16 h光照培养/8 h黑暗培养，光照度2600 lx。3～4周继代扩繁1次。

表1　供试青枯菌株材料Table1　The R. solanacearum strains used in this study

1.3室内烟草品种组培苗抗性鉴定方法的确立

1.3.1最佳接种浓度的确定 以青枯病抗性水平差异显著的烟草品种岩烟97和红花大金元组培苗作为确定最佳接种浓度的试验材料。分别挑选在1/2 MS培养基上生长至4～6叶龄期，植株大小相近岩烟97和红花大金元无菌苗各10株，超净工作台内去除干净根系周围附着的MS培养基。按1.1方法制备浓度分别为3×107cfu/mL、3×106cfu/mL和3×105cfu/mL的Tb2K9-11菌体悬浮液。参照Tripathi等的方法[5]，将组培苗植株根部分别于不同浓度的菌悬液中浸泡30 min后，灭菌滤纸吸干根部表面多余的菌液，重新栽回MS培养基内。灭菌水浸根作为对照。30 ℃，16 h光周期条件培养，隔天观察记载发病条件。

1.3.2病情严重度统计和病指计算方法[8]： 病情严重度分为5级，标准如下：0级，无症状；1级，1个叶片萎蔫；2级，2～3个叶片萎蔫；3级，4片叶片萎蔫；4级，整株死亡。病情指数按下式计算：

1.3.3参试烟草品种抗性评价 选择了青枯病抗性水平存在差异的烟草品种红花大金元、翠碧1号、云烟85、K326、G80和岩烟97，于半固体MS培养基上培养至4～6叶龄期，选取大小相近的植株。按照上述方法，采用浓度为3×106cfu/mL的Tb2K9-11菌株的细菌悬浮液进行浸根接种，每品种10株，重复3次。

1.4萎蔫组培烟苗的分子检测

由于浸菌接种操作过程中，存在非靶标微生物污染的可能。为了确证青枯菌接种体是引起烟草无菌苗产生萎蔫症状的始动因子，采用青枯菌种特异性PCR直接对病株组织悬浮进行分子检测，具体方法如下。

无菌条件下将病株主茎切成长5 mm左右的小段，于10 mL 灭菌水中静置悬浮 15～20 min。直接以1 μL悬浮液作为PCR扩增模板进行检测；同时以接种环挑取悬浮液于TZC平板上划线，30 ℃条件下培养48 h后，观察分离结果。

PCR扩增采用25 μL反应体系，其中含Taq 酶2 U，MgCl21.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，种特异性检测引物759/760各4 pmoles。反应程序为96 ℃预变性5 min，94 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s 和72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 延伸10 min[9]。5 µL PCR 产物于2.5% 的琼脂糖凝胶中电泳，电压5 V/cm，通过Biorad凝胶成像仪观察结果。

2　结 果

2.1青枯接种体材料的选择与制备

30 ℃条件下，各参试青枯菌株于TZC培养平板上活化48 ～72 h后，典型的野生型单菌落（强致病力）表现为中央呈粉红色，外缘白色的奶油状，形状不规则，具流动性（图1A）。活化培养后形成野生型单菌落的青枯菌株材料进一步进行致病力生物测定，反之则否。

在福建各烟区的主栽品种中红花大金元对青枯病最为敏感，且其对致病力强弱不同的3种青枯菌致病型的抗性表现均为高感，因此本研究以红花大金元作为各菌株致病力筛选的生物测定材料。根据生物测定接种结果，选定接种后最先导致烟苗整株萎蔫的强致病力青枯菌株Tb2K9-11作为室内抗性快速评价的接种体材料（图1B）。

2.2组培扦插苗最佳接种浓度

采用浓度为3×105cfu/mL菌悬液接种，仅出现零星发病，因此该浓度不适宜作为抗性评价的标准；采用浓度为3×107cfu/mL的菌悬液接种5 d后，开始发病，接种后13 d，红花大金元和岩烟97接种植株全部死亡（图2），两者抗病性水平无明显差异，从而表明该接种浓度过大，不适宜作为抗性评价筛选接种强度。采用浓度为3×106cfu/mL的菌悬液接种7 d后，开始零星发病，接种后19 d后，红花大金元植株全部死亡，岩烟97病情指数依然保持在40左右，两者抗病性水平存在明显差异（图2B），与此前文献报道具一定程度相关性，从而表明该接种浓度适宜作为抗性评价筛选的挑战接种强度，后续的抗性评价试验中采用了该浓度。

2.3萎蔫植株的快速分子鉴定

经青枯菌种特异性PCR检测，接种后各品种萎蔫植株均可扩增获得片段大小为280 bp的PCR产物（图3），从而表明青枯菌接种为烟苗萎蔫症状产生萎蔫的始动因子。

2.4抗性评价体系的建立

接种21 d后，红花大金元、翠碧1号、云烟85、K326、G80和岩烟97的病情指数分别为100.0、90.5、88.8、86.6、56.0和53.8（表3），品种间的青枯病抗性水平差异显著（p<0.05）；参试各品种无菌苗抗性鉴定结果进一步与已有文献报道的自然病圃鉴定[10-14]结果进行相关分析，结果表明，相关系数为0.936（p<0.05），呈显著正相关，验证了本方法的可靠性，并表明本方法能够在室内接种条件下对不同品种的青枯病抗性水平进行快速初步评价。

图1　供试接种体筛选结果Fig. 1　The result of screening of highly virulent R. solanacearum strain

图2　不同接种浓度接种抗感品种发病趋势图Fig. 2　Pathogenicity test of R. solanacearum strain Tb2K9-11 at different inoculation concentration

图3　部分萎蔫植株的分子鉴定结果Fig. 3　Partial results of molecular diagnostics of wilt in vitro plantlets

表3　参试烟草品种抗性鉴定结果Table3　Results of resistance evaluation of tobacco cultivars

3　讨 论

网室接种、人工病圃和大田自然病圃等传统方法鉴定环节繁复，通常周年或整个生育期仅可完成一次鉴定，于以下方面存在亟待改进之处。①经济可行性：大批量评价种质资源材料抗性时，需耗费大量人力、物力和财力资源；②结果稳定性与可靠性：易受气候、土壤以及病圃青枯菌系构成和初始接种体密度（自然病圃）等因素影响；③资源材料保存：无法继代重复利用，低抗材料发病过重，不利于资源保存；④生态安全：人工病圃如设置管理不当，可造成病害爆发流行，存在潜在的生态安全隐患。

其他基于温（网）室水培技术发展起来的茄子、辣椒和烟草等作物的抗性鉴定法[15-19]，虽在技术上具一定的创新性与可行性，但仍未完全突破易受环境干扰，发病缓慢与程度不足或反之，种质资源材料浪费、无法继代等制约瓶颈，因此在时间、空间、种质保存以及成本上仍无法实现高效、快捷、可持续以及经济可行性。

室内鉴定可为田间鉴定提供有力参考，其优越性在于：不受外界因素干扰，可工厂化作业和管理；可对育种研究初期获得的杂交后代，或无性系的试管苗等进行早期大量鉴定和筛选；也可对育成的优良材料在标准化条件下采用多个菌系（小种或致病型）和不同菌量接种，进行抗病性鉴定和评价[20]。杜喜梅等[21]以烟草无菌试管苗为材料研究了植物对盐逆境的生理响应。孙丽萍等[22]采用毒素培养基法建立了快速、高效、且与田间鉴定结果高度相关的烟草种质的赤星病抗性评价方法。与大多数真菌和丁香假单胞菌引起的病害不同，青枯菌不产生毒素参与其致病过程。故而本研究以无菌试管苗为材料，直接以青枯菌细胞悬浮液为接种体，并证实了采用适当的接种浓度获得的室内鉴定结果与田间鉴定结果吻合度极高，能正确反映出不同烟草品种对青枯病的抗性水平。因此，该方法可以作为评价烟草品种抗性水平的快速、可靠的高通量初筛手段，并可替代耗时、耗费、耗力的田间鉴定过程。

[1] 徐进，冯洁. 植物青枯菌遗传多样性及致病基因组学研究进展[J]. 中国农业科学，2013，46（14）：2902-2909.

[2] Kevin Leeming Ong. Bacterial wilt in South Carolina Tobacco production sys-tem: winter cover-summer crop rotation, microbial communities and the diver-sity of the causal agent, Ralstonia solanacearum in the Soutereastern United States [D]. South Carolina: Clemson University, 2001.

[3] 潘哲超，徐进，顾钢，等. 福建及贵州等地烟草青枯菌系统发育分析[J]. 植物保护，2012，38（1）：18-23.

[4] 徐进，顾钢，潘哲超，等. 福建烟草青枯病演化型及生化变种鉴定研究[J]. 中国烟草学报，2010，16（6）：66-71.

[5] Tripathi L, Odipio J, Tripathi J N, et al. Rapid technique for screening banana cultivars for resistance to Xanthomonas wilt[J]. European Journal of Plant Pathology, 2008, 121: 9-19.

[6] Wu Y L, Yi G J, Peng X X. Rapid screening of Musa species for resistance to Fusarium wilt in an in vitro bioassay[J]. European Journal of Plant Pathology, 2010, 128: 409-415.

[7] Twizeyimana M, Ojiambo P S, Tenkouano A, et al. Rapid Screening of Musa Species for Resistance to Black Leaf Streak Using In Vitro Plantlets in Tubes and Detached Leaves[J]. Plant Disease, 2007, 91(3): 308-314.

[8] He L Y, Sequeira L, Kelman A. Characteristics of strains of Pseudomonas sola-nacearum[J]. Plant Disease, 1983, 67: 1357-1361.

[9] Fegan M, Prior P. How complex is the “Ralstonia solanacearum species com-plex”[M] // Allen C, Prior P, Hayward A C. Bacterial wilt disease and Ralstonia solanacearum species complex. St. Paul: APS, 2005: 449-462.

[10] 郑继法，张建华. 烟草不同品种对青枯病菌的抗性分析[J]. 山东农业大学学报，1995，26（1）：23-29.

[11] 肖永生，黎定军，袁俊鹏，等. 对烟草青枯病苗期抗性鉴定接种方法的探讨[J]. 湖南农业科学，2000（3）：39-40.

[12] 巫升鑫，方树民，潘建菁，等. 烟草种质资源抗青枯病筛选鉴定[J]. 中国烟草学报，2004，10（1）：22-25.

[13] 纪成灿，方树民，顾钢，等. 烟草品种抗青枯病鉴定中的相关因素分析[J]. 中国烟草科学，2000，21（2）：1-4.

[14] 顾钢，纪成灿，方树民，等. 烟草主栽品种对青枯病抗性反应[J]. 云南农业大学学报，2002，17（2）：130-133.

[15] 李乃坚，黄爱兴，袁四清，等. 茄科作物抗青枯病水培法鉴定研究II.液体培养青枯菌的致病力[J]. 广东农业科学，2000（3）：38-40.

[16] 范江，刘勇，李永平，等. 烟草苗期青枯病抗性鉴定及其抗性评价方法的比较[J]. 云南农业大学学报，2014，29（4）：487-493.

[17] 李海涛，邹庆道，吕书文，等. 茄子抗青枯病的最适鉴定方法研究[J]. 辽宁农业科学，2002（1）：1-4.

[18] 许文，刘勇，姬广海，等. 烟草青枯病苗期抗性鉴定的漂浮池恒温水培接种法研究[J]. 中国烟草科学，2013，34（2）：45-48.

[19] 李梅云，刘勇，肖炳光，等. 烟草黑胫病抗性的漂浮苗鉴定方法[J]. 中国烟草科学，2014，35（1）：76-79.

[20] 李广存，金黎平，谢开云，等. 马铃薯青枯病抗性鉴定新方法[J]. 中国马铃薯，2006，20（3）：129-134.

[21] 孙丽萍，时焦，孟坤，等. 利用赤星病菌毒素快速高通量鉴定烟草抗性种质的方法研究[J]. 中国烟草科学，2014，35（1）：80-84.

[22] 杜喜梅，张俊莲，王蒂，等. 烟草试管苗对盐胁迫的生理响应[J]. 干旱地区农业研究，2007，25（4）：238-242.

《中国烟草学报》2016年第4期目次

1 基于气溶胶粒径分布测定电子烟烟雾量……………………………………………………………张 霞，韩 熠，李寿波，等

8 能量色散 X射线荧光光谱法快速测定烟草中的镉和铅…………………………….……………倪子月，陈吉文，刘明博，等

14 沾色法测定烟用接装纸耐唾液色牢度………………………………………………...……………叶长文，李 栋，贺 琛，等

23 HXD工序对料液施加效果的影响………………………………………….………………………刘献军，秦艳华，张 华，等

30 不同类型流式细胞仪检测卷烟烟气体外微核比对研究…………………..………………..……高 茜，缪明明，李雪梅，等

38 白肋烟烟叶含水率与高温贮藏过程中 TSNA形成的关系…………………….…………………孙榅淑，王 俊，许东亚，等

44 晒红烟重要致香物质与使用用途关系研究…………………………………………………….…刘善民，张 扬，王以慧，等

52 氮素形态对烟苗根系生长及氮素利用的影响……………………………………………………………………邢 瑶，马兴华

62 古巴 Pinar del Rio省优质雪茄烟种植区主要生态因子特征研究………………………………陶 健，刘好宝，辛玉华，等

70 Nicotiana tabacum-N. plumbaginifolia 杂种回交后代中筛选抗黑胫病异源染色体植株初报…..党江波，梁国鲁，郭启高，等

75 重庆烟区青枯雷尔氏菌生化变种及序列变种的特性研究……………………………….………刘 颖，唐元满，张淑婷，等

83 两个烟草 Nup96基因的分子克隆及其表达分析…………………………………………………林世锋，王仁刚，史跃伟，等

89 基于烟草叶绿体基因组和线粒体基因组 SSR标记的烟属植物遗传多样性分析………………曾建敏，陈学军，吴兴富，等

98 黄腐酸钾对渗透胁迫下烤烟幼苗生长和光合荧光特性的影响…………………………………赵永长，宋文静，邱春丽，等

107 江西烟区烟草黑胫病菌生理小种研究初报… ……………………………………………..……张超群，周泽科，陈荣华，等

111 纯电动汽车在卷烟配送中的应用探讨……………………………………………………………………………孟 博，庞 磊

117 地市烟草信息安全防护模型的构建与应用… ………………………………..………………………赖如勤，郭翔飞，于 闽

124 烟草中烟碱转化的遗传机理研究现状及展望… ………………………………………………………蔡长春，程 玲，冯 吉

Study on Granville Wilt Resistance Screening in Tobacco Using an in Vitro Plantlet Inoculation Method

XU Jin1, XU Jingsheng1, ZHANG Hao1, FENG Jie1, GU Gang2*
（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2. Tobacco Agricultural Research Institute of Fujian, Fuzhou 350003, China）

Granville wilt caused by Ralstonia solanacearum is a major limiting factor in tobacco production in China. The most economically feasible strategy to control the disease is the use of resistant cultivars. In this study, the potential of inoculation of in vitro plantlet as a rapid and reliable method for screening tobacco cultivar against R. solanacearum was investigated. In vitro plantlets of six tobacco cultivars with diverse resistance levels were inoculated with 3×106cfu/mL cell suspension of R. solanacearum strain Tb2K9-11. Twenty-one days after inoculation, the disease index of cultivar Honghuadajiyuan, Cuibi No.1, Yunyan 85, K326, G80 and Yanyan 97 was 100.0, 90.5, 88.8, 86.6, 56.0 and 53.8, respectively. There were significant correlations between in vitro plantlet assay and field trial (r=0.936). The result showed that the in vitro screening assay can help in improving tobacco breeding efficiency.

tobacco cultivar; granville wilt resistance; in vitro plantlet

S435.72

1007-5119（2016）05-0051-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.05.010

公益性行业（农业）科研专项“作物细菌性病害防控技术研究与示范”（201303015）；国家自然科学基金项目“青枯菌Po82菌株特异性III型效应子鉴定及其功能研究”（31272008）；福建省烟草公司科技项目“烟草品种对青枯病抗性快速评价体系建立的研究”{2010[035]}

徐 进（1970-），副研究员，从事植物细菌病害研究。E-mail：jinxuz@ippcaas.cn 。*通信作者，E-mail：gugang318@163.com

2015-11-03

2016-02-23