采收方式和成熟度对上部烟叶细胞结构及品质的影响

陈　刚，周清明，杨姣弟，易　克，徐向丽，周立新，田　云,4

（1.湖南农业大学农学院，长沙 410128；2.湖南省农业生物工程研究所，长沙 410128；3.湖南中烟工业有限责任公司，长沙 410006；4.湖南农业大学生物科技学院，长沙 410128）

采收方式和成熟度对上部烟叶细胞结构及品质的影响

陈刚1,2，周清明1，杨姣弟2，易克3，徐向丽3，周立新3，田云2,4

（1.湖南农业大学农学院，长沙 410128；2.湖南省农业生物工程研究所，长沙 410128；3.湖南中烟工业有限责任公司，长沙 410006；4.湖南农业大学生物科技学院，长沙 410128）

为研究烤烟上部叶采收的最适成熟特征，将云烟87上部叶按不同成熟度进行分次采收，通过外观质量和感官质量评价确定常规采收时间推迟5 d即移栽后125 d（M2阶段）对烤烟进行一次性采收，烟叶质量最优。其中移栽后125 d的顶3～顶1叶（TM2）的外观质量和感官质量评分为44.67和71.79；移栽后125 d的顶6～顶4叶（FM2）为43.36和71.75；均优于其他几个阶段。从叶片结构的细胞学变化规律看出，随着烟叶成熟度的提高，栅栏组织和海绵组织在移栽后125 d（M2阶段）开始变得疏松、细胞间隙增大、细胞中各种细胞器开始降解、淀粉颗粒积累到最饱满状态。其中移栽后125 d的顶2叶的栅栏组织厚度、海绵组织厚度、栅栏组织细胞密度和海绵组织细胞密度分别为145.3 µm、144.7 µm、43 个/mm、43 个/mm；移栽后125 d的顶5叶的栅栏组织厚度、海绵组织厚度、栅栏组织细胞密度和海绵组织细胞密度分别为139.7 µm、148 µm、42 个/mm、41个/mm。该研究进一步证实M2阶段为烤烟上部叶采收最适成熟特征。

烤烟上部叶；成熟度；细胞结构；外观质量；感官质量

目前，我国生产的上部烟叶可用性不高，很难用于一、二类卷烟配方。而造成我国上部烟可用性不高的主要原因是采收成熟度不够[1]。采收成熟度是烤后成熟度的基础，分级成熟度是烤后成熟度的根本体现，只有采收成熟度好的鲜烟叶，经过恰当的烘烤，才能获得成熟度好、品质高的烟叶，因此采收成熟度一直是烟草科学研究的重点。近年来，许多研究表明烤烟烟叶的组织结构形态直接反映了烤烟的营养状况和成熟特征，最终影响到烟叶的品质[2]。而叶片的组织结构指的是叶肉细胞的发育状况，不同成熟度烟叶的叶组织结构存在差异，许多研究结果表明，成熟烟叶的组织排列疏松、存在合适的胞间隙[3-7]。因此，本文主要通过开展不同时间一次性采收上部烟叶的试验，对烤后烟叶质量进行评价，得出上部烟叶的最佳采摘时间；同时，通过对不同成熟度采收时细胞结构变化进行研究，探明不同成熟度烟叶的细胞结构变化规律，为上部烟叶最适采收时期的确定及成熟特征的描述提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试验地及种植品种概况

本试验在云南省嵩明县牛栏江镇小新街村黑龙潭小组石则地进行，土壤为红壤砂壤土，pH 5.55，有机质25.34 g/kg，碱解氮102.2 mg/kg，有效磷76.3 mg/kg，速效钾183.5 mg/kg，种植品种为云烟87。基肥施用烟草专用肥[m(N):m(P2O5):m(K2O)= 12:8:24] 35 kg/667m2，追肥为硝酸钾5 kg/667m2。

1.2试验设计

烟株打顶时，要求打顶留叶数控制在21±1片。当烟叶采摘到只剩下6片叶时，即进入试验期。顶部6片烟叶自上向下依次挂牌如下：顶部第1叶位（简称顶1）、顶部第2叶位（简称顶2）等以此类推。对照记为M1，移栽后120和125 d两次采收，按常规方法分别烘烤后混合取样进行评价；M2、M3和M4依次推迟5 d采收，即移栽后125、130和135 d，6片叶一次采收。所有处理均将顶6～顶4与顶3～顶1分别堆放和编杆，顶6～顶4叶记为FM1、FM2、FM3、FM4，顶3～顶1叶记为TM1、TM2、TM3和TM4，用于外观质量和感官质量评分。处理见表1。

1.3检测和评价项目

1.3.1烤烟外观质量评分 烤后烟叶送往湖南中烟工业有限责任公司进行外观质量评分，评分内容分别按照：成熟度、身份、油分、色度和结构进行打分，实行50分制。

1.3.2感官评吸 评吸材料送往湖南中烟工业有限责任公司进行专业测评，评吸内容分别按照：香气质、香气量、浓度、余味和杂气等指标进行打分，实行100分制。评吸时由13名专业评吸人员组成，采用暗评的方式进行评吸。评吸的基本要求参照烟草行业YC/138—1998 烟草及烟草制品 感官评价方法中的相关条款执行。

1.3.3石蜡切片取样及数据统计 于各处理采收当天挑选正常烟株的相同叶位烟叶进行取样（从上往下数顶2叶和顶5叶，M1处理在第一次采收时进行）。所有相同叶位打孔部位应保持一致，为中心叶脉和左右周边叶缘之间1/2中线地带，打孔时要避开支脉，置于FAA固定液中，固定1周以上。

表1　试验处理Table1　The detailed table of treatments

表2　感官质量评分标准Table2　The grading standard of sensory smoking

按照：取材→复水→固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→烤片→脱蜡→复水→染色→脱水→透明→封藏流程，制作样品的石蜡切片，在AMGEVOS 荧光显微镜（×200）下观察、拍照。

1.3.4 扫描电子显微镜 取材后用3%戊二醛预固定2 h，磷酸缓冲液冲洗3次，每次间隔10 min；1%锇酸固定1 h，再用磷酸缓冲液清洗3次，每次10 min；接下来用30%，50%，70%，90%，100%，100%，100%酒精脱水各10 min，再放入叔丁醇浸泡至少2 h；最后放到冷冻干燥仪干燥置换里面的水（一般是3～4 h），喷金上机进行观察。

1.3.5透射电子显微镜 取材后用3%戊二醛预固定2 h，磷酸缓冲液冲洗3次，每次间隔10 min；锇酸固定2 h，磷酸缓冲液冲洗2次，每次间隔各10 min；1%醋酸双氧铀染色1 h；50%，70%，90%酒精脱水各10 min；100%酒精脱水1次，100%丙酮脱水1次，每次10 min；丙酮与包埋剂1:1混合液浸透1 h以上；纯包埋试剂浸透，37 ℃过夜；60 ℃，固化48 h；降温，切片，上机观察。

1.4数据分析

采用Microsoft Excel等软件进行数据处理，用SPSS 17.0软件进行数据统计分析。

2　结 果

2.1不同采收方式和成熟度上部烟叶的细胞结构

2.1.1采收方式和成熟度上部烟叶的石蜡切片观察 从图1的石蜡切片结果来看，顶2和顶5这两片叶的变化规律基本一致：随着时间的往后推移，成熟度的增加，栅栏组织和海绵组织的细胞间隙率增加。其中，在常规时间采摘（M1）阶段，细胞排列紧密、整齐；在延迟5 d采摘时间即移栽125 d（M2），细胞间呈现一定的间隙率；到延迟15 d采摘时间即移栽135 d（M4），最为明显。而通过对各组织结构的显微测量（表3），随着时间的推移，成熟度的增加，叶片的叶厚渐渐减小。栅栏组织的厚度呈减小趋势；而海绵组织厚度呈增长趋势。栅栏细胞和海绵细胞单位长度的细胞个数也反应了细胞间的密度，从表3中可以看出，随着成熟度的增加，单位面积内栅栏细胞和海绵细胞的个数均减少，说明细胞间隙呈加大的趋势。这应该跟烟叶成熟后期由于细胞内水分减少出现细胞干缩有关。

2.1.2不同采收方式和成熟度上部烟叶的扫描电镜观察 将烟叶的第5片叶进行电子扫描拍摄，从细胞的扫描电镜结果来看（图2），海绵组织在移栽后120 d（M1），125 d（M2）阶段细胞饱满；从移栽130 d（M3）开始细胞变小，细胞间隙变大；而到移栽135 d（M4），细胞明显皱缩，胞间隙进一步变大。这与细胞渐渐衰老失水，细胞器及内含物的降解有关。从栅栏组织的横切面图来看，栅栏组织与海绵组织的变化基本一致。综合上面的石蜡切片结果，扫描电镜的结果与石蜡切片组织结构的变化趋势基本保持一致。

2.1.3不同成熟度上部烟叶的透射电镜观察 从叶绿体的透射显微结果来看（图3），烟叶在移栽后120 d（M1）细胞结构完整，各种细胞器被中央大液泡挤到细胞边缘，靠近细胞壁，叶绿体中的淀粉粒处于进一步增长趋势。且从M1中可以清晰地看到排列整齐、清晰的叶绿体类囊片层。有研究认为，叶绿体类囊体的垛叠程度是决定其光合能力的主要因子[8]，所以从图中排列整齐的叶绿体类囊体可以得出该阶段仍处于淀粉合成阶段。在移栽125 d（M2），细胞中各种细胞器开始降解，类囊体膨胀、松弛，淀粉粒积累达到最大。移栽130 d（M3）时，细胞器降解严重，叶绿体膜降解，叶绿体解体，淀粉粒充斥在整个细胞中，同时，淀粉粒也开始发生降解，叶绿体中的类囊体片层基本降解完全。到移栽135 d（M4）时，各种细胞器降解完全，淀粉粒也降解严重。而从图中可以看出，线粒体并没有随着成熟度的增加而减少，即线粒体在这个过程中变化很小。

图1　石蜡切片结果图（200倍）Fig.1 The slice sample of paraffin wax at different stages

表3　不同成熟度烟叶组织结构Table3　Tissue structure of tobacco leaves with different maturity

图2　栅栏组织及海绵组织扫描电镜图Fig. 2　The Scanning electron microscopy figure of palisade tissues and sponge tissues

图3　栅栏组织细胞透射电镜图Fig. 3　Cells of palisade tissues by transmission electron microscope

2.2 采收方式和成熟度对烤烟上部叶品质的影响

2.2.1采收方式和成熟度对烤烟上部烟叶外观质量的影响 从上部叶外观质量量化鉴评结果（表4）可知，不同采收成熟度对烤后烟叶外观质量有明显的影响。顶3～1叶及顶6～4叶均以移栽125 d采摘（M2）总分最高，其中移栽125 d采摘的顶3～1叶（TM2）总分、成熟度和结构分值与其他处理相比存在显著性差异。而移栽125 d采摘的顶6～4叶（FM2）成熟度、结构和油分3项指标分值均较高，与其他处理间存在显著性差异。综上，从成熟度、身份、油份、色度、结构各项指标来看，分值均以移栽后125 d（M2）采摘者最高。

2.2.2采收方式和成熟度对烤烟上部叶感官质量的影响 从表5看出，顶3～1叶的嗅觉特征以常规采摘最好，而味觉特征则以移栽130 d采摘最佳，综合其各个方面的特征，在移栽125 d采摘得分最高，即在常规采摘推迟5 d即移栽125 d（M2）时顶3～1叶烟叶综合性能最好，该阶段为最佳采摘时间段。顶6～4叶的嗅觉特征也是常规采摘最好，味觉特征和综合分数以移栽125 d（M2）采摘者最高。

研究结果表明，无论从烟叶的烤后外观质量还是感官质量评价来看，上部烟叶在移栽125 d进行一次性采收时烟叶质量最佳，其次是移栽130 d，而常规采摘和移栽135 d采摘烤烟质量相对较差，说明未熟或过熟都影响烟叶的品质，降低其工业可用性。

表4　不同采收方式和成熟度上部叶外观质量差异Table4　Appearance of flue-cured tobacco upper leaves

表5　不同采收方式和成熟度上部叶感官质量差异Table5　Sensory quality of flue-cured tobacco upper leaves

3　讨 论

目前对烟叶细胞结构（超微结构）的研究集中在水分胁迫[9-10]、病毒侵染[11-12]等逆性条件下的结构变化规律及发育过程中的结构变化规律上[13]，对不同成熟度采收时细胞结构变化少有研究。本文通过对4个不同成熟度的上部烟叶进行细胞结构、超微结构研究，得出上部烟叶最佳采摘时期烟叶的细胞结构特征。同时，不同于前期研究的是，本文将各种方法（外观质量，感官质量评价，细胞结构等）综合起来，更加科学、全方面的研究上部叶一次性采摘的最佳时间段。

本试验设置的4个处理，M1是烟农按照以往经验采收的时间点，从试验结果来看，还未到采收的最佳时间，应该在此基础上适当延长5 d左右的时间，提高其成熟度，使上部叶烟叶品质提高。其次，传统的上部叶采收是分次采收，相比一次性采收要花费更多的人力，且从烤烟评吸结果来看，一次性采收能提高上部烟叶的成熟度，成熟度提高后，烟叶的香气质与香气量提高，杂气和刺激性降低，可用性有所提高，这与前人研究保持一致[14]。

从以上结果来看，烟叶在移栽125 d时处于适熟阶段，而对应石蜡切片及电镜检测可以看出，该阶段组织结构疏松，有机物积累较好，最适合采摘。而在常规采摘M1阶段，组织结构较为紧密，有机物积累不够充分，因此尚处于初熟阶段，不适合采摘。移栽135 d时细胞内积累物开始降解，细胞结构开始解体，因此处于过熟阶段，影响烟叶品质，也不适合烟叶的采摘，该结果与张友玉[15]等研究结果基本一致。而综合评吸结果也可知，移栽125 d采收的烟叶评吸综合分数最高，此时的烟叶价值最高，这与烟叶组织结构研究的结果相吻合。移栽125 d时烟叶对应的外观特征是叶面淡黄，落黄面积约80%，主脉支脉全白，茸毛脱落，叶缘叶尖卷曲，叶耳浅黄色，有部分焦尖现象。所以，当出现以上特征时，是烟草上部叶一次性采摘的最佳时间。

[1] 朱尊权. 提高上部烟叶可用性是促“卷烟上水平”的重要措施[J]. 烟草科技，2010（6）：5-6．

[2] 刘卫群，郭红祥，石永春，等. 配施饼肥对烤烟叶片组织结构的影响[J]. 中国农业科学，2004，37（增刊）：6-10．

[3] 李跃武，陈朝阳，江豪，等．烤烟品种云烟85 烟叶的成熟度Ⅰ成熟度与叶片组织结构、叶色、化学成分的关系[J]. 福建农林大学学报：自然科学版，2002，31（1）：16-21.

[4] 聂荣邦，李海峰，胡子述. 烤烟不同成熟度鲜烟叶组织结构研究[J]. 烟草科技，1991（3）：37-39.

[5] 冉邦定，刘敬业，李天福，等. 成熟度、施肥量、留叶数与烟叶组织结构和比叶重的关系[J]. 中国烟草，1993（2）：56-59 .

[6] 张树堂，杨雪彪，王亚辉，等. 不同成熟度烤烟鲜烟叶的组织结构比较[J]. 烟草科技，2005（1）：38-40.

[7] 王怀珠，汪 健，胡玉录. 茎叶角度在判断烤烟叶成熟度中的作用[J]. 湖北农业科学，2005（4）：79-81.

[8] Fahn A, Benayoun J. Ultrastructure of resin ducts in Pinus halepensis development, possible sites of resin synthesis and mode of its elimination from the protoplast[J]. Annals of Botany, 1979, 40: 857-863.

[9] 张华，赵百东，冀浩，等. 水分胁迫对烤烟腺毛超微结构的影响[J]. 中国烟草学报，2008，10（5）：45-47.

[10] 王逸群，周发俊，曾少娇. 淹水对烟草叶肉细胞伤害的超微结构观察[J]. 重庆科技学院学报：自然科学版，2008，6（3）：35-38.

[11] 刘国顺，张彩霞，王婵娟，等. 受烤烟花叶病病毒侵染后叶中保护酶活性和超微结构的变化[J]. 植物生理学通讯，2009，45（5）：49-465 .

[12] 黄遵锡，李红. 感染烟草花叶病毒烟叶超微结构的观察[J]. 南京师范大学学报，1995，15（2）：58-67.

[13] 王婵娟，刘国顺，贺凡，等. 烤烟发育及成熟过程中细胞超微结构的变化[J]. 浙江农业学报，2010，22（2）：234-238.

[14] 刘勇，周冀衡，周国生，等. 采收方式和成熟度对烤烟上部烟叶产质量的影响[J]. 江西农业大学学报，2012，34（1）：16-21.

[15] 张友玉. 烟草叶片组织结构的扫描电镜观察方法[J].电子显微学报，2000，19（2）：154-157.

Study on the Effect of Plucking Methods and Maturity on the Cellular Structure and Quality of Tobacco Upper Leaves

CHEN Gang1,2, ZHOU Qingming1, YANG Jiaodi2, YI Ke3, XU Xiangli3, ZHOU Lixin3, TIAN Yun2,4
(1. College of Agriculture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Agricultural Bioengineering Research Institute, Changsha 410128, China; 3. China Tobacco Hunan Industrial Co., Ltd., Changsha 410006, China; 4. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China）

In order to study the optimum mature characteristic of tobacco upper leaves for plucking, the appearance and sensory qualities of YunYan87 upper leaves were analyzed. The results showed that the date of 125 days after transplanting (M2) was the best stage of one-time plucking of upper leaves. The appearance and sensory qualities scores of the top3-1 leaves at the date of 125 days after transplanting (TM2) were 44.67 and 71.79 respectively, and the top6-4 leaves at the date of 125 days after transplanting (FM2) were 43.36 and 71.75, which were all better than those of other stages. The cytology observation of tobacco leaves indicated that the palisade tissue and spongy tissue of tobacco leaves became more loosen from the date of 125 days after transplanting (M2), with the intercellular space enlarged, organelle degraded, and the starch particles were full. The thickness and cell density of palisade tissue and spongy tissue of the top2 leaves at the date of 125 days after transplanting was 145.3 µm, 144.7 µm, 43 mm and 43 mm; The thickness and cell density of palisade tissue and spongy tissue of the top5 leaves at the date of 125 days after transplanting was 139.7 µm, 148 µm, 42/ mm and 41/mm, respectively. This research might provide the theoretical base for further verifying that the M2 stage was the optimum mature characteristic of upper tobacco leaves for plucking.

upper tobacco leaf; maturity; cellular structure; appearance quality; sensory quality.

S572.01

1007-5119（2016）05-0034-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.05.007

湖南中烟工业有限责任公司科研计划项目“提高上部叶可用性研究”（2012130134），“云南北回归线区域特色品种筛选和品质定位研究”（2010130230）

陈 刚（1982-），男，在读博士研究生，研究方向：烟草技术与工程。E-mail：8989821@qq.com。*通信作者，E-mail：tianyun@hunau.edu.cn

2016-01-11

2016-03-20