烤烟种质资源SSR核心引物的筛选及验证

马　冰，代帅帅，程亚增，蒋彩虹，任　民，程立锐，杨爱国

（中国农业科学院烟草研究所，烟草行业烟草基因资源利用重点实验室，青岛 266101）

烤烟种质资源SSR核心引物的筛选及验证

马冰，代帅帅，程亚增，蒋彩虹，任民，程立锐，杨爱国*

（中国农业科学院烟草研究所，烟草行业烟草基因资源利用重点实验室，青岛 266101）

为筛选到适合烤烟品种利用的核心引物，准确评价烟草种质资源遗传多样性和亲缘关系，利用5份遗传差异明显的烤烟种质对分布于烟草24条连锁群上的2317对SSR引物进行初步筛选，筛选出70对引物。再利用20份不同地理来源的烤烟种质对初筛引物进行复筛，最终确定24对核心引物。利用核心引物对20份烤烟种质进行遗传多样性分析，共得到85个多态性位点，平均PIC值为0.52，平均等位位点数为3.54。同时对这20份烤烟种质进行聚类分析和主坐标分析，验证24对核心引物的有效性。结果显示，两种研究方法结论一致，与种质亲缘关系吻合度较高。表明该SSR核心引物体系准确有效，可以适用于烤烟种质资源鉴定和遗传多样性分析。

烤烟；SSR核心引物；遗传多样性；聚类分析；主坐标分析

烟草是重要的经济作物，在全世界120多个国家均有种植。其中我国主栽的是普通烟草种（Nicotiana tabacum L.）的烤烟类型。在长期的烤烟育种过程中，由于集中使用几个主体亲本[1]，从而导致目前烟草品种的遗传基础狭窄[2]。研究烤烟品种的遗传多样性，分析其亲缘关系，对拓宽其种质资源的遗传基础，科学、合理地选配亲本组合具有重要的理论意义。

利用分子标记分析种质资源遗传多样性和亲缘关系已经在多种重要作物上广泛开展[3-4]。普通烟草在植物分类上属于茄科（Solanaceae）烟草属（Nicotiana），其基因组大小约4.5 G，在目前已知的茄科植物中基因组较大，并且基因组中70%以上为重复序列[5]。烟草种质资源的遗传多样性研究一直落后于其他作物，之前，烟草种质遗传分析主要采用ISSR和AFLP标记[6-7]，自Bindler等[8]公布了烟草高密度SSR标记遗传图谱后，SSR标记被广泛应用于烟草种质资源遗传多样性分析[9]。与其他标记相比，SSR标记多态性高，专一性强[10]，适合多倍体物种的遗传分析。丛鑫等[11]利用45对SSR引物将78份抗PVY的烟草种质按照遗传多样性划分为3类。陈夏晔等[12]利用34对多态性SSR引物对73份烟草抗黑胫病种质进行遗传多样性分析，结果表明其遗传多样性较差。陈雅琼等[13]和张雪廷等[14]利用SSR引物分别对烤烟、白肋烟及晾晒烟品种进行遗传多样性分析，证明了国内烤烟遗传背景狭窄，而晾晒烟品种间遗传差异性较大。尹国英[15]利用SSR引物对140份烟草种质进行分析，同样证明了晾晒烟遗传多样性丰富的结论。

目前，利用SSR标记进行烟草种质遗传分析时，如何选择有代表性的标记是研究者面临的一个问题。本研究利用烟草育种上常用的5份烤烟种质对已公布的2317对SSR标记进行初步筛选，再利用20份烤烟种质对初筛获得的引物进行复筛和验证，以便寻找出适合烟草种质遗传分析的代表性标记，为烟草种质分析奠定基础。

1　材料与方法

1.1试验材料

供试材料为我国烤烟育种过程中常用且表型性状差异较大的5份烟草种质，包括3份国内种质净叶黄、小黄金1025、革新3号和2份美国引进种质NC82、Speight G-140。20份不同地理来源的烤烟种质见表1。所有材料均由中国农业科学院烟草研究所国家烟草种质资源中期库提供。材料均在中国农业科学院烟草研究所试验基地温室种植，种植时间为2014年2月至2014年8月。

1.2试验方法

1.2.1DNA提取 在5片真叶期每份材料随机选取10株混合取样，采用CTAB法[16]提取DNA，统一稀释到50 ng/μL后，-20 ℃保存备用。

1.2.2PCR扩增及电泳检测 扩增体系为10 μL，含50 ng/μL模板DNA 1 μL、10 mol/L–1dNTPs 0.2 μL、50 ng/μL引物1 μL、5 U Taq Polymerase 0.2 μL、10×buffer 1 μL。使用Gene Amp PCR System 9700进行扩增，反应条件为94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃（根据引物退火温度调整）退火30 s，72℃ 1 min，共35次循环；72 ℃延伸7 min，12 ℃保存。使用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物，银染观察并记录数据。所用试剂均购于赛尚科贸（青岛）有限公司。

1.2.3核心引物的筛选 利用5份烤烟育种常用种质对已公布的2317对SSR引物进行初步筛选，随后利用20份不同地理来源的烤烟种质对初筛出来的引物进一步筛选，以稳定性好、条带清晰、易于统计、多态性信息量（PIC）较高并均匀分布在24条连锁群上为标准，确定核心引物。引物由六合华大（北京）基因科技有限公司合成。

1.2.4核心引物的验证 利用软件NTSYS-pc 2.11[17]，采用类平均法（UPGMA），利用筛选出的SSR核心引物对20份烤烟主要亲本进行聚类分析和主坐标（PCoA）分析[18]，验证核心引物的有效性。

1.2.5数据处理与统计分析 以0、1、9统计SSR引物扩增带型，在相同迁移率位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，缺失记为“9”，并建立相应的数据库。利用DataFormater软件[19]将原始数据转换。利用软件PowerMarker 3.25进行遗传多样性分析[20]。其中Simpson’s多样性指数也称位点多态性信息量（PIC），其计算方法为PIC=1-Σ Pi2[21]；基因型多样性H′= -Σ Pi ln Pi[22]，Pi为第i个等位基因变异出现的频率。

表1　20份供试烟草种质及其地理来源Table1　Geographical origins of twenty tested germplasms

2　结 果

2.1SSR核心引物的筛选

用5份表型和遗传差异较大的主要烤烟亲本对2317对核心引物进行初步筛选，从中筛选到70对多态性较好、带型清晰的引物，占引物总数的3.02%。随后，采用20份不同地理来源的烤烟种质对70对初筛得到的引物进行复筛，最终确定24对SSR核心引物，占复筛引物的34.29%，占总引物的1.04%。

2.2SSR引物的多态性信息

24对SSR标记在20份烤烟种质中共检测出85个等位变异，平均每个引物等位位点数为3.54。基因型多样性分析显示不同引物的变幅为0.19～0.77，平均为0.58；引物多态性信量（PIC）为0.18～0.73，平均为0.52，说明引物总体上鉴别能力尚可。其中引物PT53936的PIC值最高，表明其有极高的鉴别能力，可以将绝大多数材料鉴别出来（表2）。

表2　核心引物在参试种质中的多态性信息Table2　Polymorphism information of core primers in tested germplasms

2.3 核心引物的有效性验证

2.3.1核心引物聚类分析 根据遗传相似系数，利用UPGMA方法对20份烤烟种质（编号1～20）进行聚类分析（图1）。当聚类阀值在0.52时，可将20份种质明显分为2个类群，一类为美国种质和中国台湾种质（编号1～10），另一类为中国大陆种质（编号11～20）。第1类群又可分为3个亚群，第1亚群包括Coker319（1）和3份中国台湾烟种质T.T.8（8）、T.T.9（10）、T.T.10（9），从本研究来看，可初步确定中国台湾种质与美国种质有较近的亲缘关系；第2亚群包括FC8（2）、K326（3）、RG8（6）和Speight G-28（7）4份种质，都是由Hicks直接或间接育成；NC89（4）和NC567（5）为第3类群，2份种质都与NC2326相关，类群划分符合种质系谱关系。第2类群也可分为3个亚群，第1亚群为单育2号（12）、金星6007（13）、中烟14（17）和中烟15（18）等4份种质，它们都直接或间接来源于地方种质滕县金星；第2亚群有CF-90-NF（11）和中烟86（19），这两份种质的遗传背景中有两个共同的亲本净叶黄和Speight G-28；第3亚群的净叶黄（14）、潘圆黄（15）、长脖黄（16）和中烟98（20）4份种质都具有长脖黄的背景。

2.3.2主坐标分析（PCoA） 前两个主坐标可以解释的方差贡献率为46.06%，其中第一个可以解释的方差贡献率为34.59%。如图2所示，20份种质可以明显的分为2类。第1类群有7份美国种质（1～7）和3份中国台湾种质（8～10）；第2类群为10份中国大陆种质（11～20）。主坐标分析结果与聚类分析结果相一致，说明该套核心引物适用于烤烟种质的遗传多样性分析。

图1　基于核心引物验证材料的聚类分析Fig. 1　Cluster dendrogram of the tested accessions based on verification with core primers

图2　核心引物对验证材料进行主坐标分析的散点图Fig. 2　The scatter plot of the principal coordinates analysis on the tested accessions based on verification with core primers

3　讨 论

国内外利用SSR标记对烟草种质资源筛选以及验证工作日趋完善，杨柳等[23]运用102对SSR引物对25份普通烟草种质资源进行了遗传分析，发现97个等位基因片段，平均的等位基因片段数6.9个，PIC均值0.694，找到14个鉴定性较好的引物。陈雅琼等[13]利用SSR标记与荧光技术相结合的新方法，通过36对引物对63份烤烟和8份白肋烟进行遗传分析，进一步证实了国内栽培品种遗传基础狭窄，丰富度低的结论[24]。而张雪廷等[14]则通过30对SSR引物对38份晾晒烟进行多样性分析，平均等位基因数为5.77个，其研究表明晾晒烟有着极好的遗传丰富性。Fricano等[25]利用49对SSR标记对烤烟、深色晒晾烟、白肋烟等6类312份烟草种质进行了遗传多样性分析，结果表明，312份烟草材料相同种质间烤烟和白肋烟差异相对较少，而晾晒烟差异较大。

本研究对Bindler等[8]公布的24条烟草连锁群的2317对SSR标记进行逐一筛选，最终确定了一套（24对）适合烤烟品种遗传多样性和亲缘关系分析的核心SSR标记，该组SSR标记具有以下特征和优点：第一，该组引物扩增产物稳定，易于操作，多态性高。利用5份种质对2317对SSR标记进行了统一扩增，最大程度保证了筛选出的SSR标记扩增稳定、条带清晰单一，操作方便。第二，适合烤烟种质间的遗传多样性分析。虽然研究中供试种质遗传基础相对狭窄，亲缘关系相对简单，但聚类分析和主坐标分析结果证实，20份供试种质的类群划分真实反映了供试材料的群体结构、地理来源和亲缘关系，说明所选的24对核心引物可以清楚的检测出供试品种的遗传多样性，充分说明了该组引物高效可靠。

Lewis等[26]认为，在烤烟育种过程中集中利用少数亲本是导致遗传多样性降低的主要原因。因此，在烤烟育种过程中，利用合适的分子标记对种质资源进行遗传多样性和亲缘关系分析，选择遗传差异大的种质作为亲本，有助于扩大双亲的遗传基础，提高烟草育种的效率。

4　结 论

本研究通过不同来源的烟草种质资源筛选出适合烤烟品种使用的24对核心引物，通过聚类分析和主坐标分析验证，证明核心引物可以区分烟草品种间的差异，准确评价烟草种质资源遗传多样性和亲缘关系，也可用于烤烟种质资源筛选、遗传多样性分析，烤烟核心种质构建，以及相关育种研究工作。结果中引物PT53936的PIC值较高，是核心引物中鉴定性最好的引物，对烟草种质的筛选有重要的作用。

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Screen and Identification of SSR Core Primers for Flue-cured Tobacco Germplasm

MA Bing, DAI Shuaishuai, CHENG Yazeng, JIANG Caihong, REN Min, CHENG Lirui, YANG Aiguo*
(Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tobacco Gene Resources, Qingdao 266101, China)

The purpose of our study is screening out suitable SSR core primers which can accurately evaluate germplasm genetic diversity and genetic relationship of flue-cured tobacco. In this study, 2317 pairs of SSR primers distributed in 24 chromosomes were initially screened on 5 flue-cured tobacco cultivars with distant genetic relationship, and 70 pairs of primers were screened out. Then 20 flue-cured tobacco cultivars with different geographical origins were chosen to screen the initial selected primers. Finally, a total of 24 pairs of SSR core primers were identified. The genetic diversity of 20 flue-cured tobacco cultivars was nalyzed using these core markers. As a result, 85 polymorphism bands were acquired. The average PIC (Polymorphism information content) value is 0.52 and the mean number of alleles detected for each locus was 3.54. These 20 tobacco cultivars were conducted on both genetic diversity analysis and PCoA (Principal Coordinate Analysis) to demonstrate the effectiveness of this 24 core primers. These two methods exhibited similar phylogenesis among the tested cultivars and the results of molecular clustering largely agreed with the pedigree relationship. The results showed that the core primers were effective and accurate, and could be applied to flue-cured germplasm identification and genetic diversity study in tobacco.

flue-cured tobacco; SSR core primers; genetic diversity; cluster analysis; PCoA

S572.03

1007-5119（2016）05-0001-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.05.001

中国烟草总公司烟草基因组计划重大专项“烟草抗CMV和赤星病连锁分子标记开发及NC82、K326品种抗性改良”（110201301009）、“烟草重要性状基因发掘及功能标记开发”（110201301008）；中国烟草总公司重点科技项目“烟草抗主要病毒病（TMV、CMV、PVY）基础材料创制及育种利用”（110201402006）

马 冰（1992-），男，在读硕士。研究方向：烟草遗传育种。E-mail：jiuzhongma@163.com。*通信作者，E-mail：yangaiguo@caas.cn

2016-03-15

2016-05-22