离心超滤法测定蛋白质标记物的放射化学纯度

张云艳，万建美，钱晓敏，郭　萍，朱　然，张友九

1.苏州大学 医学部 放射医学与防护学院，江苏省放射医学与防护重点实验室，江苏 苏州　215123 2.苏州大学 卫生与环境技术研究所，江苏 苏州　215123



离心超滤法测定蛋白质标记物的放射化学纯度

张云艳1，万建美1，钱晓敏2，郭萍1，朱然1，张友九1

1.苏州大学 医学部 放射医学与防护学院，江苏省放射医学与防护重点实验室，江苏 苏州215123 2.苏州大学 卫生与环境技术研究所，江苏 苏州215123

用高效液相色谱法(HPLC)、三氯醋酸(TCA)沉淀法和超滤法分离测定125I-AAFP(抗过敏融合蛋白)标记物的放射化学纯度(RCP)，并对其进行比较。结果表明：三种方法均能有效分离标记物和游离碘，用超滤法、TCA沉淀法和HPLC三种方法测定125I-AAFP低、中、高放射化学纯度，样本的RCP分别为0.62%±0.21%、7.25%±1.38%、0.97%±0.12%，61.58%±0.52%、63.18%±1.98%、63.77%±1.23%，98.89%±0.31%、98.76%±0.41%、98.80%±0.82%。当RCP很低时，超滤法与HPLC法测得的RCP间无明显差异(P>0.05)，而要低于TCA沉淀法(P<0.05)；除此之外，三种方法无明显差异(P>0.05)。这说明离心超滤法可用于分离测定蛋白质标记物的放射化学纯度。

放射化学纯度；高效液相色谱法；三氯醋酸沉淀法；离心超滤法

放射化学纯度(radiochemical purity, RCP)是衡量放射性标记物质量的重要指标之一，直接影响核医学的实验研究和临床使用效果，常用的分离方法有纸色谱法、三氯醋酸(trichloroacetic acid precipitation, TCA)沉淀法、电泳法、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)等。对某些特殊理化性质的放射性标记物也可采用其他分离分析方法，如过滤法、离心法[1]。目前，离心超滤法广泛用于蛋白质的浓缩。本实验拟采用高效液相色谱法(HPLC)、三氯醋酸(TCA)沉淀法和离心超滤法测定125I-AAFP(抗过敏融合蛋白，anti-allergy fusion protein)标记物的放射化学纯度，以探讨离心超滤法分离测定蛋白质标记物RCP的可行性。

1　实验部分

1.1仪器与材料

2695型高效液相色谱仪、Waters 2674型紫外分光检测器、PROTEIN PAKTM300SW型凝胶柱，美国Waters公司；LB509型放射性检测器，德国Berthold公司；GC-1200 γ放射免疫计数器，中国科技大学中佳光电仪器公司；LGlO-3A高速冷冻离心机，北京医用离心机厂；XY-1型低压吸引器，上海合力医疗器械厂；XW-80A旋涡混合器，上海琪特分析仪器有限公司。

125I-NaI，上海欣科同位素公司；100 kDa超滤离心管，美国Millipore公司；Sephadex G50，Pharmacia公司；牛血清白蛋白(BSA)，美国Sigma公司；AAFP(抗过敏融合蛋白，14.9 g/L，每支15 mL)，上海富莼科芯生物技术股份有限公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.2实验方法

1.2.1125I-AAFP的制备125I-AAFP采用氯胺T法标记。取30 μL AAFP原液(14.9 g/L)至1.5 mL的Eppendoff管中，分别加入20 μL 0.2 mol/L pH=8.0磷酸盐缓冲溶液和25 μL Na125I(≈5 mCi，1 Ci=3.7×1010Bq)溶液，混匀，加入10 μL 5 g/L氯胺T溶液，混匀器上室温下反应1 min，然后加入20 μL偏焦亚硫酸钠溶液(5 g/L)，继续作用5 min，然后用Sephadex G50凝胶柱分离纯化，淋洗液为20 mmol/L pH=7.6w(BSA)=0.2% PBS缓冲溶液，每管收集0.5 mL淋洗液，活度计测每管淋洗液的放射性，TCA沉淀法测纯化后第2管淋洗液放射化学纯度为98.7%，备用。

1.2.2放化纯度的测定

1) 待测标记物的准备

125I-AAFP的3个不同放化纯度的样本：其中样本1为纯化后的125I-AAFP，高放化纯度样本；样本2为游离的125I-NaI直接加入适量未标记的AFPP，低放化纯度样本；样本3为纯化后的125I-AAFP与游离125I-NaI按2∶1比例混合配制放化纯度约为65%的样本，中放化纯度样本。为保证放射性计数测量准确性，针对不同测量仪器，将样本用生理盐水稀释到合适的放射性浓度。每种分离方法测定放化纯度设3个平行样。

2) HPLC法

125I-AAFP采用PROTEIN PAKTM300SW凝胶柱分离，流动相为0.01 mol/L的pH=6.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，流速为0.8 mL/min，进样量10 μL (约5×105min-1)，且同时用紫外分光(λ=280 nm)检测器和放射性检测器检测。紫外分光检测器主要确认保留时间，放射性检测器测定放射性水平。由放射性图谱计算125I-AAFP的放化纯度：RCP=标记物峰面积/(标记物峰面积+游离碘峰面积)×100%。

3) TCA沉淀法[2]

取标记物10 μL(约5×104min-1)，再加80 g/L牛血清白蛋白溶液10 μL、生理盐水180 μL，20%TCA 200 μL，γ放射免疫计数器测量总放射性，4 000 r/min离心10 min后，弃上清液后再测量沉淀的放射性。放化纯度计算：RCP=(沉淀的计数率/总计数率)×100%。

4) 超滤离心法

取标记物100 μL(约5×104min-1)加入超滤离心管的滤膜上，γ放射免疫计数器测量离心前放射性；4 000 r/min离心10 min，500 μL生理盐水洗三次后，γ放射免疫计数器测量离心后放射性。计算放化纯度：RCP=(离心后放射性计数率/离心前放射性计数率)×100%。

1.3统计学分析

2　结果与讨论

2.1HPLC分离

蛋白质标记物的放化纯度测定的常用方法有纸层析法、三氯醋酸(TCA)沉淀法、薄层层析法、电泳法、高效液相色谱法(HPLC)等。HPLC因其分离效果好，常用于多肽和蛋白质标记物的分离测定，但此法的费用和技术要求相对高，且配备的放射性检测器的灵敏度低，限制了其应用[3]。

3种不同放化纯度样品分别经PROTEIN PAKTM柱分离，其HPLC紫外和放射性谱图示于图1。从图1可以看出，125I-AAFP、125I-NaI在紫外和放射性检测器的保留时间(tR)分别为(14.54±0.24)、(23.85±0.22) min和 (15.82±0.06)、(24.32±0.03) min。由图1(e,f)可见，HPLC能有效地分离125I-AAFP和游离碘，它们的保留时间与图1(a,b,c,d)一致。

2.2放化纯度

HPLC、TCA沉淀法和离心超滤法三种不同方法测定3种不同放化纯度样本的放化纯度结果列于表1。选用不同类型凝胶色谱柱的HPLC可有效分离蛋白质和游离的放射性核素，是目前公认的放射化学纯度分离测定的精确可信的分析方法。实验结果表明，TCA沉淀法分离测定蛋白质标记物(125I-AAFP)的放射化学纯度，在高、中放化纯度时，与HPLC法无显著性差异(P>0.05)，而在低放化纯度时，与HPLC法有显著性差异，这主要是由游离放射性核素在蛋白质中非特异性吸附造成的。TCA沉淀法也是一种重现性和精密度较高的蛋白质分离方法，且简便、快速、易行，但对于其他放射性标记物，此方法行不通[4]。超滤是指在对溶液施加一定的压力后，高分子物质就被超滤管中膜所截留，而水和低分子物质透过滤膜的过程[5]。离心超滤法分离测定放化纯度不会受放射性标记物种类的限制，分离分子量相差较大的物质效果较好，并且非特异性结合也很低。只要选择合适截留分子量的超滤管，就能有效分离测定放射化学纯度。文献[6]中放射性125I标记的纳米粒子就是用离心超滤法进行放射化学纯度测定的。利用离心超滤法测定大分子标记物放射化学纯度是一种可行的方法。

(a,c,e)——紫外谱图，(b,d,f)——放射性谱图；(a，b)——样本1，(c,d)——样本2，(e,f)——样本3图1　样本1、2、3的HPLC谱图Fig.1　HPLC spectra of sample 1, 2, 3

表1　3种方法测定的125I-AAFP放化纯度Table 1　Determination of RCP of 125I-AAFP with three different methods

注：1) 与HPLC法比较P<0.05

3　结　论

离心超滤法分离测定蛋白质标记物(125I-AAFP)的放射化学纯度，在高、中、低放化纯度都与HPLC法一致，无显著性差异(P>0.05)。因此离心超滤法可用于分离测定蛋白质标记物的放射化学纯度。

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Determination on Radiochemical Purity of Labelled Protein With Centrifugal Ultrafiltration

ZHANG Yun-yan1, WAN Jian-mei1, QIAN Xiao-min2,GUO Ping1, ZHU Ran1, ZHANG You-jiu1

1.School of Radiation Medicine and Protection (SRMP), Medical College of Soochow University,Jiangsu Province Key Laboratory of Radiation Medicine and Protection, Suzhou 215123, China;2.Sanitation & Environment Technology Institute, Soochow University, Suzhou 215123, China

To explore the determination of radiochemical purity(RCP) of labelled protein with centifugal ultrafiltration, the radiochemical purity of125I-AAFP(anti-allergy fusion protein) was determined and compared by high performance liquid chromatography(HPLC), trichloroacetic acid(TCA) precipitation and centrifugal ultrafiltrations. It shows that three methods can separate the labelled125I-AAFP and free iodine-125 efficiently. The lower, middle and higher radiochemical purity of125I-AAFP which are determined by centrifugal ultrafiltration, TCA and HPLC respectively are 0.62%±0.21%, 7.25%±1.38% and 0.97%±0.12%; 61.58%±0.52%, 63.18%±1.98% and 63.77%±1.23%; 98.89%±0.31%, 98.76%±0.41% and 98.80%±0.82%. When RCP of125I-AAFP is very lower, the RCP measured with HPLC is not different from that with centrifugal ultrafiltration(P>0.05), whereas lower than that with TCA(P<0.05). Except this, there are no significant differences in the RCP of125I-AAFP determined with three different methods (P>0.05). Centrifugal ultrafiltrations can be used to determinate the radiochemical purity of labelled protein.

radiochemical purity(RCP); high performance liquid chromatography(HPLC); trichloroacetic acid(TCA) precipitation; centrifugal ultrafiltration

2016-05-31；

2016-07-26

O658

A

0253-9950(2016)05-0317-04

10.7538/hhx.2016.38.YX.2016061