重组胶原蛋白制备及其应用研究进展

唐云平,郑　强,胡　斌,蔡　谨,黄　磊,徐志南,*

(1.浙江大学化学工程与生物工程学院,浙江杭州 310027;2.浙江丽水学院生态学院,浙江丽水 323000)



重组胶原蛋白制备及其应用研究进展

唐云平1,郑强2,胡斌1,蔡谨1,黄磊1,徐志南1,*

(1.浙江大学化学工程与生物工程学院,浙江杭州 310027;2.浙江丽水学院生态学院,浙江丽水 323000)

胶原蛋白由于其独特的理化性质和生物功能,在食品、化妆品、生物医学等领域的应用日益广泛。然而,从动物组织中提取的胶原蛋白存在动物源疾病等风险,限制了其许多潜在用途的开发。重组(类)胶原蛋白具有与天然胶原蛋白相似的性质和功能,近年来,国内外学者对重组(类)人胶原蛋白的表达进行了广泛的研究。本文综述了近年来重组(类)人胶原蛋白表达、分离纯化和应用方面的研究进展,为该重组蛋白的制备提供指导意义。

胶原蛋白,类胶原蛋白,重组表达,纯化,应用

胶原蛋白是动物细胞外基质中的一种主要结构蛋白。它由三股α-螺旋结构的肽链缠绕形成的纤维状蛋白,其一级结构由(Gly-X-Y)n重复序列组成,其中X通常为脯氨酸,Y为羟脯氨酸或羟赖氨酸[1]。近年来,胶原蛋白被广泛用于食品、化妆品、生物医学等领域。胶原蛋白主要从动物结缔组织中提取获得,但从动物组织中提取的胶原蛋白存在动物源疾病等风险,限制了其潜在应用和开发[2]。因此,利用基因工程技术生产重组胶原蛋白就显得非常重要。本文对重组(类)人胶原蛋白的国内外研究进展进行了综述并介绍了其在食品、化妆品和生物医学等领域中的应用,为该重组蛋白的制备提供指导意义。

1　胶原蛋白和类人胶原蛋白

胶原蛋白是结缔组织中最主要的结构蛋白,它的基本结构是原胶原,每个原胶原分子都由三条α肽链组成,而每个α肽链都会形成左手螺旋,三条左手螺旋扭在一起形成一个大的右手螺旋结构(图1)。胶原蛋白的种类多,结构复杂,目前发现的胶原蛋白至少有28种,但其基本结构却大同小异。

图1　胶原蛋白的三维螺旋结构Fig.1　Human collagen structures that arevisualized using PDB:IBKV in three different forms注:Tube(A),CPK(B)and ball and stick model(C)。

类人胶原蛋白则是根据人胶原蛋白的特性进行优化或引入特殊功能的氨基酸序列,通过重组表达获得的具有类似胶原蛋白特性的蛋白。与传统提取获得的胶原蛋白相比,主要具有可加工性、无病毒隐患、水溶性好、批次稳定和排异反应低等优点。

2　重组(类)人胶原蛋白的异源表达

目前,许多重组表达系统被应用于(类)人胶原蛋白的重组表达,如大肠杆菌、酵母、动物细胞、转基因动物和转基因植物等,重组(类)人胶原蛋白的表达情况见表1。

表1　(类)人胶原蛋白在各表达系统中的表达总结

2.1利用大肠杆菌表达(类)人胶原蛋白

大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的蛋白质表达系统,其遗传背景清楚,发酵成本低、生产周期短、效率高,可以快速大规模生产外源蛋白,具备规模化生产外源蛋白的潜力。目前,重组大肠杆菌生产的(类)人胶原蛋白主要分为羟基化和非羟基化两大类。

2.1.1非羟基化的类人胶原蛋白大肠杆菌表达系统由于自身缺乏脯氨酸羟化酶,因此在单独表达胶原蛋白时不能获得羟基化的胶原蛋白。Yin等[3]在大肠杆菌中表达类人胶原蛋白[(GAPGAPGSQGAPGLQ)52],通过条件优化可获得0.1～0.2 g/L的重组类人胶原蛋白。Yao等[4]在大肠杆菌中表达类人胶原蛋白([GERGDLGPQGIAGQRGVV(GER)3GAS]8),产量为50～70 mg/L。

2.1.2通过添加羟脯氨酸获得羟基化人胶原蛋白大肠杆菌自身缺乏脯氨酸羟化酶,但培养过程中,在含有高浓度NaCl的培养基中添加羟脯氨酸,可获得羟基化的重组胶原蛋白[5]。但该法合成的胶原蛋白与来自于组织中的天然胶原有一定程度的差异,羟脯氨酸在Gly-X-Y三联体中的X和Y位置均可能出现,X位的脯氨酸发生羟化后会使得胶原蛋白的热稳定性减弱。

2.1.3通过与羟化酶共表达获得羟基化(类)人胶原蛋白将(类)人胶原蛋白和脯氨酸羟化酶基因一起在大肠杆菌中共表达可获得羟化的类人胶原蛋白。目前使用的脯氨酸羟化酶基因主要有病毒来源的羟化酶和人源脯氨酸羟化酶。例如,Rutschmann等[6]在大肠杆菌中将人源III型胶原蛋白和病毒来源的脯氨酸羟化酶一起共表达,获得羟化的重组胶原蛋白,产量为90 mg/L。但该羟化酶既能催化Gly-X-Y三联体中X位的脯氨酸,也能催化Y位上的脯氨酸。因此,有必要对该羟化酶进行分子改造,提高该酶对底物的专一性,使重组胶原蛋白的热稳定进一步增强。本课题组[1]通过将类人胶原蛋白、人源脯氨酸羟化酶和D-阿拉伯糖-1,4-内酯酶基因一起在大肠杆菌中共表达,获得了羟化的类人胶原蛋白,产量为0.26 g/L。虽然在大肠杆菌中可获得羟化的类人胶原蛋白,但产量普遍不高,为满足市场上对胶原蛋白的需求还须不断的探索与改进。

2.2利用酵母表达(类)人胶原蛋白

迄今为止,利用酵母表达(类)人胶原蛋白的研究较多,如毕赤酵母、汉逊酵母和酿酒酵母等[7-8,12-13]。其中利用毕赤酵母表达获得的重组(类)人胶原蛋白的表达量和羟化效率最高。例如,Myllyharju等[7]将人源胶原蛋白I、II和III基因整合到含脯氨酸羟化酶的毕赤酵母工程菌中,获得的重组胶原蛋白均能被充分羟基化且产量为0.2～0.6 g/L。通过进一步优化发酵工艺条件,重组人源I、II和III型胶原蛋白在毕赤酵母中的产量分别可达1.1、0.7、1.5 g/L[8]。总得来说,(类)人胶原蛋白能够在毕赤酵母中进行充分的羟基化表达,且随着发酵产量的逐步提高,具备工业化生产的前景。

2.3利用动植物表达(类)人胶原蛋白

国外对胶原蛋白在转基因动植物中的重组表达也进行了大量的研究,如转基因鼠、蚕、玉米和番茄等。例如,Toman等[9]利用鼠的乳腺细胞中表达重组I型人胶原蛋白,产量为8 g/L,但该表达系统的培养基昂贵,操作繁琐并不适合商业化生产。Adachi等[10]在蚕的中部丝腺中表达人I型胶原蛋白αI,重组蛋白在蚕茧中的含量达8%。Stein等[11]在番茄中将I型人胶原蛋白、人源脯氨酸羟化酶和赖氨酸羟化酶基因进行共表达,产量为20 g/L且羟脯氨酸和羟赖氨酸的含量分别为7.55%和0.74%,和天然I型人胶原蛋白非常接近,该技术已被Collplant公司用来商业化生产重组I型人胶原蛋白。

3　重组(类)胶原蛋白的分离纯化

重组蛋白的分离纯化是发酵产品规模化生产的限制因素,纯化费用约占生产成本的20%～30%,甚至更高。目前,重组(类)胶原蛋白的分离纯化方法主要有:亲和层析法、盐析沉淀法、离子交换层析法和凝胶过滤层析结合法等。Tang等[1]利用亲和层析对重组类人胶原蛋白进行了分离纯化,回收率为68.6%。王晓军等[14]利用硫酸铵沉淀、DEAE-52阴离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析对破碎液中重组类人胶原蛋白进行大规模的分离纯化,最终产物纯度达98%,回收率为80.5%,达到了工业化生产的要求。

4　重组胶原蛋白的应用

4.1在食品领域中的应用

胶原蛋白在食品领域中的应用,主要包括以下几方面:作为功能性食品和保健品，经常食用胶原蛋白丰富的食品可增加皮肤组织细胞的储水能力,增强和维持肌肤良好的弹性,延缓肌体衰老;作为肉制品改良剂,可影响肉类的嫩度,改善产品品质,提高蛋白质含量;作为食品包装材料,如人工肠衣等。重组(类)胶原蛋白应用于食品领域的报道不多,俞园园将锌和钙等微量元素与重组类人胶原蛋白进行螯合,获得类人胶原蛋白-锌、类人胶原蛋白-钙等螯合物,为补钙或补锌等制剂的制备奠定基础[15-16]。

4.2在化妆品领域中的应用

胶原蛋白中含有大量羧基和羟基的氨基酸,如羟脯氨酸、羟赖氨酸以及甘氨酸等天然保湿因子,对皮肤具有很好的保湿效果。此外,胶原蛋白多肽与皮肤细胞的生长、分裂、增殖、迁移以及分化有关,可提供养分从而延缓皮肤衰老并且还具有促进皮肤的创面修复和抗辐射的作用,因而广泛用于化妆品领域。

4.3在生物医学领域中的应用

胶原蛋白具有低抗原性、可生物降解性、生物相容性和促进血小板凝聚等生物学特性,是非常重要的天然生物材料。重组人源I型胶原蛋白制备成的海绵具有多孔微观结构和低炎症反应的特性,可被运用于细胞组织的再生[8]。重组人源II型胶原蛋白能刺激细胞外软骨基质的更新合成,被应用于软骨再生[17]。此外,重组胶原蛋白还被应用于混合仿生学或互穿网络支架,如制备人工角膜等[18]。

5　前景与展望

由于其特有的三重螺旋结构和功能特性,胶原蛋白可广泛用于食品、化妆品、化工和生物医学等领域。虽然利用重组表达系统生产(类)胶原蛋白的研究取得了一些进展,但是还有很多问题亟需解决。相信随着技术水平的进步和人们对基因重组蛋白的认可,重组(类)胶原蛋白在食品、化妆品和生物医学等领域的应用也将得到进一步的提高。

[1]Tang YP,Yang XL,Hang BJ,et al. Efficient production of hydroxylated human-like collagen via the co-expression of three key genes inEscherichiacoliOrigami(DE3)[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2015:1-13.

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[3]Yin J,Lin JH,Li W T,et al. Evaluation of different promoters and host strains for the high-level expression of collagen-like polymer in Escherichia coli[J]. Journal of Biotechnology,2003,100(3):181-191.

[4]Yao J,Yanagisawa S,Asakura T. Design,expression and characterization of collagen-like proteins based on the cell adhesive and crosslinking sequences derived from native collagens[J]. Journal of Biochemistry,2004,136(5):643-649.

[5]Buechter DD,Paolella DN,Leslie BS,et al. Co-translational incorporation of trans-4-hydroxproline into recombinant proteins in bacteria[J]. The Journal of Biological Chemistry,2003,278(1):645-650.

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Research progress on preparation and application of recombinant collagens

TANG Yun-ping1,ZHENG Qiang2,HU Bin1,CAI Jin1,HUANG Lei1,XU Zhi-nan1,*

(1.College of Chemical and Biological Engineering,Zhejiang University,Hangzhou 310027,China;2.College of Ecology,Lishui University,Lishui 323000,China)

Collagens have been widely used in food,cosmetic and biomedicine for its unique physical and chemical properties and biological functions. However,collagens used in these fields were commonly extracted from animal tissues,thus its application was limited by the risk of animal-derived contaminating pathogens and difficulties in the preparation. Recombinant human collagen-like proteins have the some properties and functions as the natural collagens. In recent years,human collagen-like proteins have been expressed in a variety of expression systems. The new research progress of bio-production and purification of recombinant collagen-like proteins and their application have been reviewed in this paper. This work will be helpful to the large-scale preparation of the recombinant human collagen-like proteins in the future.

collagen;collagen-like protein;recombinant expression;purification;application

2016-03-23

唐云平(1985-)，男，博士研究生，研究方向：生物化工，E-mail：11128056@zju.edu.cn。

徐志南(1966-)，男，博士，教授，研究方向：生物化工，E-mail：znxu@zju.edu.cn。

国家自然科学基金(21306164)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)18-0384-03

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.065