冰岛刺参胶原蛋白多肽对PC12细胞氧化损伤的保护作用

赵　芹,林　栋,刘海梅

(1.鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;2.滨州医学院药学院,山东烟台 264003)



冰岛刺参胶原蛋白多肽对PC12细胞氧化损伤的保护作用

赵芹1,林栋2,刘海梅1

(1.鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;2.滨州医学院药学院,山东烟台 264003)

目的:研究不同分子量范围的冰岛刺参胶原蛋白多肽C1(6 ku

冰岛刺参,胶原蛋白多肽,PC12细胞,活性氨基酸,抗氧化

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种老年高发的渐进性神经退行性疾病,其发病机制与氧化应激及其引起的相关损伤密切相关[1]。近年来,寻找具有抗氧化活性的天然生物活性物质用于保护神经细胞免受氧化损伤备受关注。

海参是一种药食同源的海洋棘皮动物,因富含海参胶原蛋白、皂苷、多糖、脑苷脂等活性物质而具有很高的食用及药用价值。在海参体壁的活性物质中蛋白质(多肽)含量最高,可达干品比重的90%[2]。采用蛋白酶酶解海参体壁制备得到的水解产物,已被证明具有保护内皮细胞[3]、抑制ACE酶活性[4]、减少黑色素生成[5]、提高记忆力和抗疲劳[6]等生理活性,其显著的抗氧化活性[7-8]更是引起广泛的关注。

冰岛刺参(Cucumariafrondosa)主产于大西洋北部,其口感较差,食用价值低,研究并利用其体内的生物活性成分,可有效利用低值海参资源,提高其经济价值。目前对于冰岛刺参的研究主要集中在整参以及海参岩藻聚糖硫酸酯和岩藻糖基化硫酸软骨素的生物活性研究[9-11],对其胶原蛋白多肽的生物学活性及作用机制则鲜有报道。本实验采用酶解法和膜分离技术制备不同分子量段的冰岛刺参(C.frondosa)胶原蛋白多肽,采用H2O2诱导PCl2细胞建立氧化应激损伤神经元的模型,比较不同分子量范围的冰岛刺参胶原蛋白多肽对神经细胞的保护作用,为推动低值海参生物活性物质的合理开发利用,深入挖掘海参胶原蛋白多肽的药用功能提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

干品冰岛刺参(C.frondosa)市售,由中国科学院海洋研究所廖玉麟研究员对样品进行种属鉴定;复合风味酶活力500 LAPU/g,Novo Nordisk公司;PC12细胞株中国科学院上海生化与细胞研究所;高糖DMEM培养基、胎牛血清美国Gibco公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)美国Amresco公司;乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒南京建成生物工程研究所;ROS试剂盒、Caspase-3活性检测试剂盒海门市碧云天生物技术研究所。

835-50型氨基酸自动分析仪、F-2500型荧光分光光度计日本HITACHI公司;TS-100型倒置生物显微镜日本Nikon公司;680型酶标仪美国BIO-RAD公司。

1.2实验方法

1.2.1胶原蛋白多肽的制备参照文献[5],采用乙醇连续浸提脱除皂苷等小分子物质后,以复合风味酶在最适反应条件下酶解4 h(酶与底物比为1∶4、pH6.5、温度45 ℃)。采用截留分子量为6 ku和10 ku的超滤膜处理,得到不同分子量的酶解液。于40 ℃旋蒸浓缩,真空冻干,分别得粉末状冰岛刺参胶原蛋白多肽C1(6 ku

1.2.2细胞培养用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养PC12细胞,每2 d以0.25%的胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.3对正常细胞PC12细胞增殖率的影响收集对数生长期的PC12细胞,调整密度至2×104个/mL,以200 μL/孔接种于96孔培养板。培养24 h后,分别加入C1或C2处理,浓度设置为12.5、25、50、100 μg/mL,正常对照组不加样品,每组4个复孔,培养时间为24、48和72 h。采用MTT法[12]测定吸光度OD570值,按以下公式计算各组细胞增殖率。

1.2.4对H2O2损伤PC12细胞存活率的影响收集对数生长期的PC12细胞,调整密度至1×105个/mL,以100 μL/孔接种于96孔培养板。培养24 h后,加入C1和C2预处理12 h,浓度设置为6.25、12.5、25、50和100 μg/mL,正常对照组和模型对照组不加样品,每组4个复孔。随后换液、洗涤,除正常对照组外,各组分别加入含有H2O2(80 μmol/L)的无血清DMEM培养基孵育4 h。以MTT法测定吸光度OD570值,细胞增殖率的计算同1.2.3。

1.2.5细胞内活性氧(ROS)水平测定收集对数生长期的PC12细胞,调整密度至5×105个/mL,以2 mL/孔接种于6孔培养板。分别加入C1和C2预处理12 h,样品的浓度为50、100 μg/mL。随后换液、洗涤,加入200 μmol/L的H2O2(预实验确定6孔板内此浓度下细胞的存活率在60%左右)处理4 h,收集细胞。参照试剂盒说明,加入DCFH-DA(10 μmol/L)探针孵育20 min,以无血清培养基洗涤细胞3次。细胞内荧光强度用荧光分光光度计测定,激发波长为488 nm,发射波长为521 nm,以细胞悬液的平均荧光强度表示细胞总的ROS水平。

1.2.6LDH释放量、细胞内MDA含量和抗氧化酶活性的测定细胞处理及培养条件同1.2.5,样品的浓度为25、50和100 μg/mL。实验结束时收集培养上清液和细胞,按照试剂盒说明,分别以比色法测定上清液中LDH释放量,TBA法测定细胞内MDA含量、羟胺法测定PC12细胞内SOD活力,比色法测定细胞内GSH-Px活性,钼酸铵比色法测定CAT活性。细胞蛋白浓度以Folin-酚法[13]测定。

1.2.7Caspase-3的酶活性的测定细胞分组、处理及培养条件同1.2.6,实验结束时收集细胞,加裂解液,冰浴中裂解15 min。于4 ℃,20000×g离心10 min。取上清,按照试剂盒说明,加入底物Ac-DEVD-pNA,测定Caspase-3的酶活性。细胞蛋白浓度以Bradford法[13]测定。

1.2.8氨基酸组成分析采用盐酸水解法[14]分别处理冰岛刺参胶原蛋白多肽C1和C2后,使用氨基酸自动分析仪测定其主要氨基酸含量。

1.2.9统计学处理数据为至少4次的平行数据结果,以平均数±标准差表示,采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析,同时采用LDS法进行两两比较,采用SNK法进行组间比较,以p<0.05为差异有显著性,p<0.01为差异极显著。

2　结果与分析

2.1对正常PC12细胞增殖活力的影响

PC12细胞株源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤,该细胞株可高分化为交感神经样细胞,且同时具有神经分泌细胞和神经元的性质,已被广泛用于神经细胞保护活性的研究[15]。由图1可见,冰岛刺参胶原蛋白多肽C1和C2对PC12细胞的生长无显著性影响(p>0.05),表明不同分子量冰岛刺参胶原蛋白多肽对神经细胞无细胞毒作用。

图1　C1和C2对PC12细胞增殖的影响Fig.1　Effects of C1 and C2 on PC12 cells proliferation rates

2.2对H2O2损伤PC12细胞存活率的影响

H2O2作为重要的ROS成分之一,在细胞培养体系中可分解羟基自由基(·OH),引起神经细胞的氧化应激损伤。由图2可见,H2O2(80 μmol/L)能极显著性地抑制PC12细胞生长(p<0.01),与正常对照组比较,其增殖率下降为67.61%。采用C1和C2预处理细胞后,当剂量大于50 μg/mL时,PC12细胞的增殖活性均极显著地提高(p<0.01),且呈现出明显的剂量-效应关系。其中,冰岛刺参C2组最低起效浓度为12.5 μg/mL,低于C1组(25 μg/mL),其余各剂量组效果相当。董玉婷[16]等研究了鳕鱼皮胶原蛋白多肽对小鼠B16黑素瘤细胞的作用,实验结果显示,不同分子量的超滤组分对细胞的生长均有促进作用,并且分子量段越小的组分,最低有效浓度越小。以上结果表明,多肽的吸收速率与其分子量相关,C2组分子量小,因此更易进入细胞发挥其生理功能。

图2　C1和C2对H2O2损伤PC12细胞的保护作用Fig.2　Protective effects of C1and C2on PC12 cells injury induced by H2O2注:与模型对照组比较,*表示差异显著(p<0.05),**表示差异极显著(p<0.01)。

2.3对H2O2损伤PC12细胞内ROS水平的影响

图3　C1和C2对H2O2损伤PC12细胞内ROS的影响Fig.3　Effects of C1 and C2 on intracellular ROS in PC12 cells injured by H2O2注:与正常对照组比较,##表示差异极显著(p<0.01);与模型对照组比较,*表示差异显著(p<0.05),**表示差异极显著(p<0.01)。

2.4对H2O2损伤PC12细胞LDH释放量和MDA含量的影响

为了进一步评价冰岛刺参胶原蛋白多肽对自由基损伤神经细胞的保护作用,进一步测定了细胞LDH的释放量和MDA含量。经H2O2损伤后,PC12细胞的膜结构及完整性被破坏,细胞内酶LDH大量释放,培养上清中LDH含量为正常组的1.96倍(表1)。与模型对照组相比,经冰岛刺参胶原蛋白多肽预处理后,C1和C2各剂量组LDH释放量平均降低了26.31%(p<0.01)和32.26%(p<0.01),呈现出了显著和极显著保护作用,其中C2各剂量组的效果均优于C1。实验结果表明,不同分子量的冰岛刺参胶原蛋白多肽均能有效减少H2O2对细胞的损伤,降低LDH的释放量,维持细胞膜结构及其完整性。MDA是脂质过氧化的最终产物,可直接反映机体内自由基含量的变化和受自由基攻击的程度。由表1可见,经C1和C2预处理后,细胞内的MDA含量呈剂量依赖性下降,其中高剂量组MDA含量分别下降了37.10%和46.29%。

表2　C1和C2对H2O2损伤PC12细胞抗氧化酶活性的影响

凌玉芳等[19]研究了乳清蛋白酶解物对PC12细胞氧化损伤防护作用的体外研究,结果发现,乳清蛋白酶解产物对H2O2诱导氧化损伤的PC12细胞具有显著的防护作用。其中样品组MDA显著低于模型组,与本实验结果一致,说明两种多肽均可显著抑制ROS引发的脂质过氧化反应,有效减少脂质过氧化产物的产生。但是与本实验结果不同的是乳清蛋白酶解产物对LDH水平的影响不显著,原因可能样品处理细胞的方式不同。本实验中细胞是经过样品预处理12 h后再进行H2O2损伤,而非两者同时作用于细胞。因此,C1和C2可预防性的改善细胞内的氧化还原水平,从而可以更好的抵御H2O2对细胞膜的损伤,减少细胞内酶的外漏。

表1　C1和C2对H2O2损伤PC12细胞LDH和MDA的影响

注:与正常对照组比较,##表示差异极显著(p<0.01);与模型对照组比较,*表示差异显著(p<0.05),**表示差异极显著(p<0.01);表2、图4同。

2.5对H2O2损伤PC12细胞内抗氧化酶的影响

王奕等[22]研究发现日本刺参胶原蛋白多肽可显著提高光老化模型小鼠血清和皮肤中SOD、GSH-Px和CAT活性。林琳[23]等研究证实,鱿鱼皮胶原蛋白多肽具有抗氧化活性,对羟自由基和超氧阴离子具有较好的清除效果,并可提高动物体内SOD、GSH-PX活力,降低丙二醛MDA含量。与其结果类似,本实验中,C1和C2均可显著提高H2O2诱导损伤的神经细胞中SOD、CAT和GSH-Px的活性,提示冰岛刺参胶原蛋白多肽不仅可通过清除ROS减少神经细胞氧化损伤,还可以通过提高自身抗氧化酶活性,增强细胞抵御氧化应激损伤的能力来保护神经细胞。

2.6对H2O2损伤PC12细胞中Caspase-3酶活性的影响

Caspase-3是细胞凋亡程序中的终末执行酶,可剪切procaspase-3、6、7和9,以及许多Caspase底物如PARP,促进细胞骨架降解和DNA片段化,最终导致细胞凋亡[24]。有研究报道,线粒体内ROS的累积会直接或间接损伤线粒体膜,造成线粒体膜电位下降,线粒体膜间腔内细胞色素C释放入胞浆,从而激活Caspase-3[25]。如图4所示,与正常对照组相比,H2O2诱导后PC12细胞的Caspase-3酶活性较正常对照组极显著上升(p<0.01)。凌玉芳[19]研究发现,乳清蛋白酶解物对H2O2诱导损伤细胞的凋亡有抑制作用,可以降低H2O2引起的Caspase-3酶活性的提高。本实验中,采用不同浓度的C1和C2预保护后,Caspase-3酶活性较模型对照组均显著降低(p<0.05),各剂量组平均酶活分别下降了20.84%和36.17%。经SNK分析,C2抑制Caspase-3酶活性升高的效果优于C1。表明冰岛刺参胶原蛋白多肽在细胞内通过减少细胞内ROS的累积,保护细胞内膜结构完整性,阻止了细胞凋亡关键酶Caspase-3的激活。

图4　C1和C2对H2O2损伤PC12细胞Caspase-3酶活性的影响Fig.4　Effects of C1 and C2 on Caspase-3 activity in PC12 cells injured by H2O2

2.7冰岛刺参胶原蛋白多肽的主要氨基酸组成

由于特殊的生态环境,海洋生物富含结构新颖、功能独特的高生物活性药用成分。与陆生胶原肽相比,海洋胶原蛋白肽也具有许多独特的生理功能和理化性质[26]。大量研究表明,海洋胶原蛋白多肽具有广泛的抗氧化活性,且其抗氧化活性与肽链的氨基酸组成和氨基酸的性质(酸性氨基酸、疏水性、亲水性及芳香族氨基酸的含量和种类)等因素相关[22-23,27]。有研究证明,疏水性氨基酸的多肽可通过抑制脂质中氢的释放或与氧结合,减缓脂质过氧化反应进程,进而保护脂质体系与膜质完整性[28]。除疏水性氨基酸外,酸性氨基酸的侧链氨基及羧基基团可与金属离子螯合,并减弱其引发的一系列自由基链式反应,从而达到抗氧化效果[29]。

由表3可见,冰岛刺参胶原蛋白多肽C1和C2中抗氧化氨基酸含量均十分丰富,尤其是还原性氨基酸总量上,C1和C2的含量分别高达52.87 mg/100 mg和57.66 mg/100 mg,显著高于崔凤霞[18]报道的仿刺参(A.japonicus)胶原肽(47.69%)、墨西哥刺参(I.fuscus)胶原肽(48.91%)和菲律宾刺参(P.graeffei)胶原肽(25.46%)。在疏水性氨基酸和酸性氨基酸方面,C2的含量分别为33.38%和28.79%,均高于C1。彭新颜[27]等研究发现,经超滤后分子量在1～4 ku的蓝点马鲛鱼皮抗氧化肽段·OH清除率高达55.1%,显著优于超滤前水解物。与其报道类似,本实验中分子量<6 ku的C2具有更好的抗氧化活性,提示低分子量段的冰岛刺参胶原蛋白多肽在保护神经细胞活性方面效果更佳,可能与其肽链结构以及氨基酸组成相关。

表3　冰岛刺参胶原蛋白多肽的主要活性氨基酸组成

注:a:还原性氨基酸;b:疏水性氨基酸;c:酸性氨基酸。

3　结论

本实验研究发现,不同分子量的冰岛刺参胶原蛋白肽均可显著降低细胞内氧化应激水平,并可以通过提高自身抗氧化酶活性和抑制凋亡因子Caspase-3激活两条途径来保护受损的神经细胞。低分子量段的胶原蛋白肽抗氧化活性更优,可能与其肽链结构和氨基酸组成相关。本研究为海参胶原蛋白多肽在治疗阿尔兹海默病中的应用提供了理论依据,同时也为低值海参的深加工及高值化利用提供了新的思路。

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Protective effects of collagen polypeptides fromCucumariafrondosaon oxidative damage in PC12 cells

ZHAO Qin1,LIN Dong2,LIU Hai-mei1

(1.School of Food Engineering,Ludong University,Yantai 264025,China;2.School of Pharmacy,Binzhou Medical University,Yantai 264003,China)

Objective:To investigate the protective effects of collagen polypeptides with different molecular weights fromCucumariafrondosaon neural cells damaged by oxidative stress. Methods:Well-differentiated PC12 cells had been culturedinvitro,to establish an oxidative damage model of neural cells by hydrogen peroxide(H2O2). PC12 cells were pretreated with different concentrations of C1and C2,accordance with the final concentration 0,12.5,25,50,100 μg/mL. The viability of the cells was measured by MTT method. Cells were then divided into the control group,damage group(H2O2)and collagen polypeptides protection groups(collagen polypeptides+H2O2). The reactive oxygen species(ROS),the content of MDA,the outleakage of lactic dehydrogenase(LDH),the activities of antioxidase and Caspase-3 in PC12 cells were measured by corresponding kits. Results:When the dose was higer than 50 μg/mL,C1and C2could promote the growth of PC12 injured by H2O2observably(p<0.01). The level of intracellular ROS of high dose group cells were decreased significantly(p<0.05). The LDH release,the content of MDA of middle and high dose group cells were decreased significantly(p<0.01). The activities of SOD,GSH-Px and CAT of middle and high dose group cells were stimulated remarkably(p<0.05). The activity of apoptosis factor Caspase-3 was decreased significantly(p<0.05).Conclusion:Collagen polypeptides fromCucumariafrondosacould play a neuroprotective role in PC12 cells oxidative damaged by H2O2. The more significant effect of the collagen polypeptides with low molecular weight correlated to their amino acids composition in all probability.

Cucumariafrondosa;collagen polypeptides;PC12 cells;active amino acid;antioxidant

2016-04-11

赵芹(1983-)，女，博士，讲师，研究方向：海洋生物活性物质，E-mail:candyffff@163.com。

山东省自然基金(ZR2015PC002,ZR2014BP016)；鲁东大学人才引进基金(LY2012011)。

TS284

A

1002-0306(2016)18-0354-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.059