蜂花粉中黄酮类化合物的鉴定和含量测定

王　京,钟世欢,王庆龄,陈青俊,周　兵

(浙江公正检验中心有限公司,浙江杭州 310009)



蜂花粉中黄酮类化合物的鉴定和含量测定

王京,钟世欢,王庆龄,陈青俊,周兵

(浙江公正检验中心有限公司,浙江杭州 310009)

以24种不同蜂花粉为材料,对其中微量特征成分黄酮类化合物进行鉴定和归纳。建立一种高压液相色谱-串联三重四级杆质谱法快速测定蜂花粉中8种黄酮类化合物的方法。破壁的试样经乙醇溶液提取后加酸水解,经反相色谱分离,质谱定性并测定8种黄酮类化合物含量,外标法定量。该方法线性良好,R2均大于0.999,检出限为0.15～3.0 mg/kg,精密度为3.2%～6.6%,回收率在91.2%～100.2%,此方法操作简便,抗基质干扰、结果可靠。分析结果证实,蜂花粉中黄酮类化合物通常有槲皮素、山奈酚、芦丁等。可为识别蜂花粉的植物来源,鉴别真伪和建立相应的指纹图谱提供研究方法和实验依据。

蜂花粉,黄酮,指纹图谱,LC-MS/MS

目前在淳于自然的营养保健品中,蜂花粉受到越来越多人的青睐。蜂花粉源自花蕊中的花粉粒,号称“微型营养库”[1]。花粉具有丰富氨基酸、糖类、脂类、黄酮类、皂苷、甾体、萜类化合物等营养物质,具有抑菌、抗疲劳、降血脂、抗氧化等医疗保健作用[2-3]。其中蜂花粉丰富的黄酮类物质因其具有抗氧化、消除自由基作用[4],更是成为研究的热点。目前提取花粉中黄酮类物质的方法主要有热回流法、微波法、萃取法、超声法、酶解法、温差法、温差-超声法、温差-酶法及超声-微波协同萃取法等[5-7]。测定黄酮含量的方法有比色法[8],分光光度法[9],反相高效液相色谱法[10],HPLC-DAD及HPLC-MS法等[11-14];但是这些方法和研究存在检测灵敏度不高,前处理繁琐及重现性不佳,定性不准确,样本数量欠缺等不足。随着蜂花粉市场需求的扩大,一些不良商家造假掺假等问题日益严重;随着从整体上研究复杂物质体系的指纹图谱技术的发展和应用,也为蜂产品的真伪鉴定提供了可能。本研究通过优化色谱条件、质谱条件、预处理方法,最终建立了超高压液相色谱-串联三重四级杆质谱法快速测定蜂花粉中8种黄酮类化合物的方法;并且以24种不同蜂花粉为材料,对其中微量特征成分黄酮类化合物进行鉴定和归纳,为鉴别蜂花粉的植物来源和地源属性提供依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，美国TEDIA公司;氢氧化钾、无水乙醇、盐酸均为优级纯，上海谱振生物科技有限公司;1∶1氢氧化钾溶液(100 g氢氧化钾用100 mL水溶解混匀);杨梅素、山奈酚、槲皮素、高良姜素、芹菜素、乔松素、杨梅素、白杨素标准物质中国食品药品检定研究院,纯度≥98%。

Agilent 1200超高效液相色谱仪串联6430三重四极杆质谱仪美国Agilent公司;Eppendorf Centrifuge 5804R高速冷冻离心机德国Eppendorf公司;AS 3120超声波振荡器天津特赛恩斯仪器有限公司;Millipore-iQ高纯水净化仪美国Millipore公司;DFY-500 摇摆高速中药粉碎机中国精胜科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样品处理

1.2.1.1超声提取法准确称取2.0 g(精确到0.1 mg)蜂花粉试样,加入40 mL 80%乙醇以53 KHz频率超声提取15 min,4000 r/min离心5 min后转移上清液;重复提取一次后合并清液用乙醇定容至100 mL,用0.22 μm滤膜过滤,供液相色谱串联质谱仪测定。

1.2.1.2温差-超声提取法准确称取2.0 g(精确到0.1 mg)蜂花粉试样,加入50 mL 80%乙醇以53 KHz频率超声提取15 min,于-18 ℃冷冻过夜后取出立即放入100 ℃水浴,放冷用乙醇定容至100 mL,4000 r/min离心5 min后经0.22 μm滤膜过滤,供液相色谱串联质谱仪测定。

1.2.1.3温差-酸水解法准确称取2.0 g(精确到0.1 mg)蜂花粉试样,加入50 mL 80%乙醇以53 KHz频率超声提取15 min,于-18 ℃冷冻过夜后取出立即放入100 ℃水浴,加入2.0 mL盐酸,用80%的乙醇定容至100 mL后转移至平底烧瓶,称重后70 ℃水浴水解1 h,放冷后用KOH溶液调pH至中性后用80%乙醇溶液补足重量,4000 r/min离心5 min后经0.22 μm滤膜过滤,供液相色谱串联质谱仪测定。

1.2.2色谱参考条件色谱柱:Angilent SB-C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)或性能相当的色谱柱。流动相:A:0.2%甲酸水溶液,B:0.2%甲酸乙腈溶液。流速:0.3 mL/min。梯度洗脱:0～3 min,10% B～15% B;3～5 min,15% B～20% B;5～7 min,20% B～40% B;7～9 min,40% B～65% B;9～11 min,65% B～80% B;11～12 min,80% B～90% B;12～13 min,90% B～90% B;13～14 min,90% B～10% B。柱温:30 ℃。进样量:2 μL。

1.2.3质谱条件离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:正离子模式;检测方式:多反应监测(MRM);干燥气温度:350 ℃;干燥气流速:9 L/min;雾化气压力:45 psi;毛细管电压:+4000 V。

2　结果与分析

2.1色谱条件的优化

选取甲醇、乙腈、甲醇和乙腈的混合溶液作为有机相,考察了流动相对色谱分离度和灵敏度的影响。结果表明:从灵敏度上看,乙腈>甲醇乙腈混合液>甲醇;乙腈作为流动相时各目标物出峰时间虽然更早但是分离度更好,峰强度增大,峰形尖锐。正离子模式下加入一定量的甲酸可以增强离子化效率,经比较0.1%、0.2%、0.3%的甲酸浓度对峰形和灵敏度的影响,结果显示当甲酸浓度在0.1%～0.2%的范围内随浓度增加灵敏度增强,超过0.2%时多数目标物灵敏度下降明显,故选择0.2%作为甲酸添加量。同时为保证梯度洗脱的稳定性,在乙腈中也加入0.2%的甲酸。最终确定0.2%甲酸水溶液～0.2%甲酸乙腈溶液梯度洗脱的流动相体系。

2.2质谱条件的优化

黄酮类化合物分子结构中含有羰基等多电子基团,易于ESI源的正离子模式下形成[M+H]+准分子离子,采用三通方式在ESI+模式下分别对8种黄酮类化合物的单标溶液进行一级质谱全扫描分析,确定准分子离子峰,再使用子离子扫描模式,选择丰度合适的定量和定性子离子。同时对碰撞能和裂解电压等参数进行优化,最终确定的质谱参数见表1。

表1　质谱参数表

8种黄酮类化合物的MRM色谱图见图1,其中a～h依次为芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚、芹菜素、高良姜素、乔松素和白杨素。

图1　8种黄酮混合标准溶液的MRM色谱图Fig.1　The MRM chromatogram for 8 flavonoids

2.3提取方式的优化

由于植物细胞壁对目标物的提取会有很大的影响,以粉碎机预破壁后的猕猴桃蜂花粉为实验对象,考察直接超声提取、温差法破壁后酸水解、温差法破壁后超声提取三种提取方式对杨梅素含量、山奈酚的影响,结果见图2。

图3　8种黄酮类化合物碎裂方式Fig.3　The fragmentation modes for 8 kinds of flavonoids

图2　三种提取方式的比较Fig.2　The comparison of 3 kinds of extraction

由图2可知,温差-酸水解法得率最高,可能是由于酸水解可以破坏植物细胞壁并将各种结合态的黄酮苷转化为对应的黄酮苷元,故选择温差-酸水解法作为本实验提取方式。

2.4黄酮类物质结构分析

由ESI+MS2图谱可知,8种黄酮类物质具有共同的特征碎片离子m/z 153,可以推测其断裂方式如图3。

可见黄酮类化合物具有相似的质谱行为,其分子离子化后产生的准分子离子[M+H]+均以如图4所示断裂。

图4　二级质谱下黄酮类化合物的普遍碎裂方式Fig.4　The common fragmentation modesfor flavonoids on tandem mass spectrometry

结合文献资料的分析,m/z 153是黄酮母体结构在C环发生RDA反应的结果。通过对24种不同蜜源或地缘的蜂花粉的ESI+SCAN分析发现蜂花粉提取物在一级质谱扫描时产生的主要特征碎片有m/z 104、255、257、271、287、303、319、380、438、611、622、663等,可以推测其主要是一些多酚类、黄酮类物质。

2.5不同来源蜂花粉中黄酮种类定性分析

通过对24种不同蜜源或地源属性的蜂花粉中8种黄酮化合物ESI+MRM定性分析,结果见表2。

表2　蜂花粉中黄酮种类定性分析表

注:√表示检出。

由表2可知,不同蜜源的蜂花粉之间黄酮类物质种类差异明显,同蜜源不同地缘的蜂花粉中荷花、芸芥花、荞麦花等黄酮种类接近,而葵花、油菜花等黄酮种类差异也较大。实验还发现经酸水解后能从葡萄糖苷键键合的黄酮苷中释放出黄酮苷元,如油菜蜂花粉经溶剂提取后直接测定未测得山奈酚而经酸水解后可得,可能是由于其天然状态下以山奈酚-3,4′-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的形式存在于油菜蜂花粉中,因此要准确测定含量须经酸水解将结合态的黄酮转化为黄酮本体。

表3　标准物质线性参数表

注:a代表本方法,b代表GB/T 19427-2003。

2.6指纹图谱的建立

取24种不同蜂花粉,在ESI+SCAN条件下进行指纹图谱分析并记录色谱图,结果显示不同植物来源的蜂花粉之间并无明显联系,而同源的蜂花粉可以建立相应的指纹图谱。本实验选取4种油菜花蜂花粉建立指纹图谱,可用于鉴定油菜蜂花粉的植物来源,结果如图5。

2.7线性关系和检测限

将标准工作液按浓度由低到高进样,在1.2中所述仪器条件下测定,分别以黄酮类化合物的浓度为横坐标,以对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,并回归得到线性方程。标准物质线性参数见表3。

由表3可知,8种黄酮类化合物在各自标准曲线浓度范围内线性良好,灵敏度足够进行蜂花粉中黄酮类化合物的鉴别和含量测定。

2.8精密度和回收率

对3种不同种类蜂花粉分别进行加标回收实验,考察精密度和回收率,结果见表4。

由表4可知,8种黄酮类化合物加标样品平均回收率在91.2%～100.2%之间,相对标准偏差为3.2%

表4回收率实验表(n=6)

Table 4The experiment list for recovery(n=6)

化合物添加量(mg/kg)油菜花蜂花粉荷花蜂花粉茶花蜂花粉回收率(%)RSD(%)回收率(%)RSD(%)回收率(%)RSD(%)杨梅素38.295.96.193.85.2100.26.5槲皮素10.192.83.293.74.196.35.9芦丁10.292.56.691.35.396.95.5芹菜素4.8591.23.693.34.795.46.3松属素4.7095.14.294.93.992.95.5高良姜素1.9093.43.794.53.991.96.1白杨素1.9794.44.791.54.993.95.1山奈酚4.3195.43.992.55.192.34.3

图5　油菜蜂花粉指纹图谱Fig.5　The fingerprint of rape pollen注:1～4分别为表2中的油菜蜂花粉1,油菜蜂花粉2,油菜蜂花粉3,油菜蜂花粉4。

～6.6%,本方法具有较高的准确度和精密度。

3　结论

粉碎后的试样经温差法破壁,乙醇溶液提取后加酸水解,后用甲醇溶液稀释,经反相色谱分离,质谱定性并测定黄酮苷元含量,外标法定量。该方法线性良好,检出限为0.15～3.0 mg/kg,精密度为3.2%～6.6%,回收率在91.2%～100.2%,此方法操作简便,抗基质干扰、结果可靠,适合蜂花粉中常见黄酮类物质的含量的准确测定。经MS分析后归纳,不同来源蜂花粉中黄酮主要以槲皮素、山奈酚、芦丁等形式存在,根据蜜源不同还有以高良姜素、芹菜素等特征形式存在的黄酮类化合物,同蜜源不同地的蜂花粉也存在一些差别。本研究通过对黄酮结构和蜂花粉提取物的质谱分析,也为建立蜂花粉中黄酮类物质指纹图谱进行其植物源的真实属性判定提供了研究方法和依据。

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Identification and detection of flavonoids in bee pollen

WANG Jing,ZHONG Shi-huan,WANG Qing-ling,CHEN Qing-jun,ZHOU Bing

(Zhejiang Gongzheng Inspection Center Co.,Ltd.,Hangzhou 310009,China)

To establish a quick,accurate and sensitive approach to analyse flavonoid contents using 24 kinds of bee pollen as material,a method called ultra-high pressure liquid chromatograph with tandem triple level 4 pole mass spectrometry had been set up in this research,aimed to detect 8 types of flavone. After crushed the wall of samples by temperature,differential method stepped by the acid hydrolysis through ethanol extraction and finally diluted with methanol solution,the targets aimed to detect were seperated by reversed-phase chromatography,measured by mass spectrometry and quantitated by external standard method. Statistics indicated that this method had a good linear withR2>0.999,its RSD was less than 6.6 percent and more than 3.2 percent. The LOD was between 0.15 and 3.0 mg/kg along with a hight recovery rate ranged from 91.2% to 100.2%. Depended on its easier operation,reliable result with lower matrix interference,this method could be applied to other flavonoids contents in bee pollen such as quercetin,kaempferol,rutin and so on. Last but not the least,it could also provide experimental bases and research methodology to identify the plant origin for bee pollen,distinguish authenticity further to build revelant fingerprint.

bee pollen;flavone;fingerprint;LC-MS/MS

2016-03-11

王京(1987-),男,在职硕士研究生,工程师,研究方向:食品检测技术开发与食品安全,E-mail:178058645@qq.com。

赞宇科研基金资助项目。

TS207.3

A

1002-0306(2016)18-0085-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.008