五味子和芍药醇提取物对气道成纤维细胞增殖的影响

杨 柳，黄 科，杨 艳，陈 霞，冯 静

·论著·

五味子和芍药醇提取物对气道成纤维细胞增殖的影响

杨 柳，黄 科，杨 艳，陈 霞，冯 静

目的 探讨芍药和五味子醇提取物对人成纤维细胞增殖活性的影响。方法 采用渗滤提取法制备芍药和五味子醇提取液，分别用0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、1.25 g/ml醇提取物刺激人胚肺成纤维细胞72 h，观察醇提取物对人胚肺成纤维细胞形态、增殖活性、细胞周期的影响。结果 不同浓度醇提取物均可抑制成纤维细胞增殖，但无明确的量效关系；醇提取物浓度达到0.0625 g/m l时，不仅能抑制人胚肺成纤维细胞增殖，且可将细胞阻滞于G0/G1期，减少进入DNA合成期的细胞。结论 芍药和五味子醇提取物可有效抑制人胚肺成纤维细胞增殖，且0.0625 g/m l可能为最适宜浓度。

醇提取物；气道成纤维细胞；增殖；浓度

气道重塑是哮喘的重要病理特征之一，也是哮喘难以治愈的关键因素。在哮喘病程中，气道上皮细胞在炎症因子作用下分泌大量促纤维化生长因子，以及β型转化生长因子（TGF-β），促使成纤维细胞增生，并分化演变成肌原成纤维细胞导致气道重塑。因此，抑制成纤维细胞增殖已成为控制哮喘气道重塑的治疗方向。本课题组经多年的临床研究，并在大量前期研究基础中发现，具有高抗氧化活性的五味子和芍药醇提取物对哮喘气道重塑有良好治疗效果。因此，本研究将进一步探讨此醇提取物对气道成纤维细胞增殖活性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 人胚肺成纤维细胞株（human embryonic lung fibroblast，HELF）（中国科学院细胞库），细胞培养瓶（Corning公司），特级胎牛血清（GIBCO），CCK-8试剂盒（日本同仁），细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒 （碧云天生物技术研究所），细胞培养板（NEST）。

1.2 方法

1.2.1 芍药和五味子醇提取物制备 取合格芍药和五味子，分别粉碎，各取500 g混合，以70%乙醇润湿，装渗滤筒，渗滤液位约12倍体积的70%乙醇，收集渗滤液，减压浓缩，回收乙醇，至样品浓度为1.6 g/m l药材，即得。

1.2.2 不同浓度醇提取物对HELF形态的影响

原代HELF培养传代至3代HELF接种于6孔板，将 1.6 g/ml醇提取物原液用生理盐水稀释成0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、1.25 g/ml不同浓度，分别加入HELF培养板中培养24、48、72 h，镜下观察细胞形态。

1.2.3 不同浓度醇提取物对HELF增殖活性的作用 取对数生长期HELF常规消化，调整细胞为5×104个/ml，以104个/孔细胞密度接种于96孔培养板中，37℃、5%CO2条件下培养。细胞贴壁后随机分成6组，第1组只加入无血清DMEM 50μl作为空白对照组；2～5组加入等量的用无血清DMEM配制的醇提取液，浓度分别为0.03125、0.0625、0.125、 0.25、0.5 g/ml，37℃、5%CO2条件下培养48 h。吸出培养液，各孔加入10μl的CCK-8液，继续培养4 h，小心吸弃培养液。应用酶标仪450 nm处测定各孔的吸光值（OD值）。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率 取第4代生长良好的HELF细胞，培养液中加入浓度分别为0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5 g/ml的醇提取物，继续培养48 h，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，离心收集细胞，弃上清，用PBS洗涤3次，加入700ml/L冷乙醇2ml混匀，置于4℃冰箱固定24 h，1000 r/min离心5 min，弃乙醇，用PBS洗涤3次，调整细胞浓度为4.0×105/ml，加入碘化丙锭300μl，混匀，4℃避光染色1 h，流式细胞仪（激光波长488 nm）检测，结果经CellQuest软件分析处理得出细胞凋亡率。

2 结果

2.1 不同浓度醇提取物对HELF形态的影响 镜下可见醇提取物浓度为 1、1.25 mg/ml时，加入HELF中，细胞在24 h内出现大批凋亡；而在浓度为0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5 g/ml时，HELF可存活 72 h。当醇提取物浓度为 0.03125 g/m l及0.125 g/ml时，HELF的形态变化最具特征 （图1、2）。从图1、2中可以看出，醇提取物有明确抑制人成纤维细胞生长的作用，且随着浓度增高抑制作用越大。

2.2 醇提取物对HELF增殖活性的影响 醇提取物作用24 h开始对HELF有明显抑制作用，因抑制作用较强，在24、48、72 h时的抑制作用比较无统计学差异（P＞0.05）。从图3中可以看出，0.03125 g/ml浓度组与0.0625 g/m l组比较有显著差异（P＜0.05），而当浓度＞0.0625 g/ml后，随着浓度增加，OD值无显著差异（P＞0.05）。提示0.0625 g/m l可能为抑制作用最强且能维持细胞活性最适宜浓度。

图1 0.03125 9/m l醇提取物作用不同时间时，HELF的形态变化（×100）左图：作用24 h；中图：作用48 h；右图：作用72 h

图2 0.125 9/m l醇提取物作用不同时间时，HELF的形态变化（×100）左图：作用24 h；中图：作用48 h；右图：作用72 h

图3 气道成纤维细胞增殖

2.3 不同浓度醇提取物对HELF细胞周期的影响及凋亡率 作用48 h后，随着醇提取物浓度增加，G0/G1期细胞比例逐渐增加，S期细胞比例明显减少。醇提取物浓度为0.0625 g/ml时的凋亡率显著高于0.03125 g/ml时（P＜0.05），而后更高浓度时的凋亡率基本不再增加。见表1。

3 讨论

支气管哮喘是气道慢性炎症性疾病，长期慢性炎症过程中，支气管黏膜下成纤维细胞（FB）受转化生长因子-β（TGF-β）等刺激而增殖，并产生大量细胞外基质（ECM），沉积于基底膜。最新研究发现，慢性未治疗及激素抵抗性哮喘患者无论血液还是气道黏膜，都存在持续高水平的FB，而这些大量的FB正是持续气道炎症和气道重建的主要因素之一。另外，哮喘患者的气道上皮细胞也可吸引FB聚集，导致Th2淋巴细胞、嗜酸性粒细胞促进血液FB的重塑和增生功能增强。气道黏膜高水平的FB还可放大Th2淋巴细胞炎症，甚至可增加病毒感染后炎症反应，释放大量致炎因子。因此，抑制FB增殖，减少ECM产生，阻止哮喘气道重建，对改善哮喘预后有重要意义。本课题组在前期的研究中，发现了五味子和芍药醇提取物不仅能有效改善气道重塑，而且无论体内或体外均具有高抗氧化活性，此提取方法已获国家发明专利（专利号2013100708612）。

为了进一步探求醇提取物对FB最适宜的抑制浓度，本研究将1.6 g/ml醇提取物用生理盐水稀释成不同浓度，加入HELF中培养72 h。镜下可见1、1.25 g/ml醇提取物加入后，24 h内HELF很快出现凋亡，因此，在后期测定HELF增殖曲线、凋亡率时未采用这两个浓度。随之，课题组检测了醇提取物对HELF增殖活性、细胞周期的影响及48 h凋亡率，发现当醇提取物浓度达到0.0625 g/m l时，能有效抑制FB增殖，且可将细胞阻滞于G0/G1，减少进入DNA合成期的细胞，因此，0.0625 g/ml可能为醇提取物抑制FB增殖的最适宜浓度。

但是，为何具有高抗氧化活性的五味子和芍药醇提取物可有效抑制FB的增殖，加速FB的凋亡，以及这些功能是否与前期研究中提到与细胞因子水平调节有关，目前仍不清楚，还需在下一步研究中证实。

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Effects of extracts from fructus schisandrae and paeonol on airway fibroblasts proliferation

Yang Liu，Huang Ke，Yang Yan，Chen Xia，Feng Jing
Department of Pediatrics，Hospital 324 of PLA，Chongqing，400020，China

Objective To explore the effects of extracts from fructus schisandrae and paeonol on airway fibroblasts proliferation. Methods Extracts from fructus schisandrae and paeonol were prepared by percolation extraction method.Human embryonic lung fibroblast（HELF）was stimulated with 0.03125，0.0625，0.125，0.25，0.5，1 and 1.25 g/m l extracts for 72 h to observe the effects of such extracts on themorphology，proliferation activity and cell cycle of HELF.Results All extracts of different concentration could inhibit fibroblasts proliferation，but there was no clear dose-effect relationship；when the concentration of extractwas 0.0625 g/m l，the extracts could not only inhibit the proliferation of HELF but also arrest cell cycle in G0/G1，so as to reduce the number of cells entering DNA synthesis phase.Conclusion The extracts from fructus schisandrae and paeonol can effectively inhibit the proliferation of HELF，and 0.0625 g/m lmay be themostappropriate concentration.

ethanol extract；airway fibroblasts；proliferation；concentration

表1　不同浓度醇提取物对HELF细胞周期的影响及凋亡率

R 284.2

A

1004-0188（2016）10-1093-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.10.001

2016-04-06）

重庆市基础与前沿研究计划（重点）项目（cstc2015jcyj BX0062）

400020重庆，解放军324医院儿科

陈 霞，E-mail：06chenxia@163.com