“营卫通络方”对动脉粥样硬化早期颈动脉交感神经的调节作用

尹玉洁，马柳一，贾振华，张军芳，王宏涛，单星阁，刘　焕

(1.河北中医学院研究生学院,河北 石家庄　050090;2.河北以岭医药研究院,河北 石家庄　050035;3.河北中医学院附属以岭医院,河北 石家庄　050091;4.河北沧州中西医结合医院,河北 沧州　130900)



◇复方药物药理学◇

“营卫通络方”对动脉粥样硬化早期颈动脉交感神经的调节作用

尹玉洁1,2,3，马柳一4，贾振华1,2,3，张军芳2，王宏涛2，单星阁2，刘焕2

(1.河北中医学院研究生学院,河北 石家庄050090;2.河北以岭医药研究院,河北 石家庄050035;3.河北中医学院附属以岭医院,河北 石家庄050091;4.河北沧州中西医结合医院,河北 沧州130900)

目的观察“营卫通络方”对兔动脉粥样硬化早期交感神经的影响。方法将家兔随机分为正常组、高脂组、复合模型组、桂芍通络高(GSTL-H)、桂芍通络低(GSTL-L)剂量组，阿托伐他汀(ATO)组。正常组给予普通饲料，高脂组给予高脂饮食建立高脂血症模型，复合模型组及各用药组实施高脂饮食复合右侧颈动脉硅胶管包裹术。灌胃(ig)给药，qd，GSTL-H组给予桂芍通络0.6 g·kg-1·d-1，GSTL-L组给予桂芍通络0.3 g·kg-1·d-1，ATO组给予阿托伐他汀2.5 mg·kg-1·d-1，连续至4周时取材。生化法检测各组血脂水平变化，HE染色检测颈动脉形态学变化，ELISA法检测动脉壁中NE含量，免疫组化法检测NGF,TH分布密度,Western blot检测NGF及TH蛋白含量。结果与正常组相比，高脂组和复合模型组血清TC、TG、LDL-C水平明显升高；复合模型组内膜增生程度，NE含量、交感神经分布密度(NGF,TH蛋白分布与表达)较高脂组更重(P<0.01)；与复合模型组相比，桂芍通络高、低剂量组可不同程度减轻血脂水平及内膜增生程度，降低管壁NE含量及交感神经密度(P<0.05,P<0.01)。结论“营卫通络方”-桂芍通络能够减轻兔颈动脉粥样硬化程度，其机制可能与调节动脉壁交感神经有关。

动脉粥样硬化；血管外膜；营卫通络方，桂芍通络；阿托伐他汀；交感神经；神经调节

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是冠心病及脑血管卒中等心脑血管疾病的共同病理基础[1]，是一种慢性炎症性病理过程，其基本病变过程为动脉内膜脂质沉积，内膜纤维化，斑块形成，致血管壁变厚，管腔狭窄[2]，不仅侵犯大中动脉，也会引起微循环系统的改变[3]。近年研究发现血管外膜存在的单核细胞、巨噬细胞及T细胞等多种外源性细胞，能够促进局部炎性因子表达，因此提出了AS“由外向内(Outside-in)”发病机制[4]，使得血管外膜在AS病变过程中的作用日益受到关注和重视。

血管外膜不仅构成血管的支撑结构，提供滋养血管，同时集神经-内分泌-免疫功能于一体，解剖学研究发现，大、中动脉周围的神经支配明显多于静脉、小动脉以及毛细血管，主要以去甲肾上腺素能和胆碱能神经纤维为主[5]，这一血管周围神经分布的特点与AS病变好发于大中动脉血管相吻合，提示血管周围神经可能参与AS病变的发生和发展。桂芍通络是以脉络学说和营卫理论为指导研制而成的“营卫通络方”[6]，本研究通过观察外膜损伤后局部交感神经分泌变化，探讨AS早期病变与血管周围交感神经的相关性及通络干预作用。

1　材料与方法

1.1药品与试剂阿托伐他汀片(辉瑞制药有限公司，批号：L14578)；桂芍通络超微粉(石家庄以岭药业股份有限公司 将桂芍通络按临床所用剂量比例称取，采用水提、醇提、提油等制备工艺，浓缩干燥制成胶囊原粉，每克桂芍通络超微粉相当于6.93g生药)；NGF兔多克隆抗体(英国Biorbyt公司，货号：orb11126)；TH兔多克隆抗体(英国Biorbyt公司，货号：orb224025)；Norepinephrine ELISA kit(Abnova公司)。

1.2实验分组与模型建立健康♀♂各半日本大耳白兔72只，体质量(2.0±0.3) kg，(购自北京富豪实验动物养殖中心，实验动物许可证号：SCXK(京)2010-0010)，单笼饲养于河北络病重点实验室。12 h明暗周期，温度(20～25)℃，湿度40%～70%，定时通风消毒。适应性喂养2周后随机分为6组：正常组、高脂组、复合模型组、桂芍通络高(GSTL-H)、桂芍通络低剂量组(GSTL-L)、阿托伐他汀组(ATO)。正常组给予正常饲料，高脂组给予高脂饮食喂养[7](胆固醇1%、猪油5%、胆固醇7.5%及基础饲料86.5%)，模型组及各药物干预组均实施高脂饮食复合右侧颈动脉硅胶管包裹术。各治疗组于造模当天同时给予药物干预，用0.5%羧甲基纤维素钠混悬液将药物配置成所需浓度，按以下剂量灌胃给药，桂芍通络高剂量0.6 g·kg-1、桂芍通络低剂量0.3 g·kg-1、阿托伐他汀2.5 mg·kg-1，给药容积为3 mL·kg-1，每天1次，灌胃给药，连续4周。右侧颈动脉硅胶管包裹术具体步骤[5]如下：3%戊巴比妥钠(1 mL·kg-1)经兔耳缘静脉注射麻醉后，将兔仰卧固定于手术台上，颈部备皮消毒后，沿正中线逐层剪开皮肤、筋膜并钝性分离右侧胸锁乳突肌，眼科镊配合玻璃分针仔细游离出右颈总动脉(RCA)2.5 cm，纵向剖开并消毒硅胶管(内径1.7 mm，外径3.2 mm，长2 cm)包裹于右颈动脉，避免伤到鞘膜内的交感、迷走神经。滴加链霉素后逐层缝合伤口，术后每天2次，连续3 d行局部消毒。

1.3指标检测标本采集前禁水禁食12 h，3%戊巴比妥钠(1 mL·kg-1)经兔耳缘静脉注射麻醉后，腹主动脉取血，备皮消毒后，行颈部正中切开，迅速分离并取下术侧颈动脉，生理盐水洗净，分别置入4%多聚甲醛溶液及液氮。

血脂水平测定：腹主动脉取血后，静置30 min后，以3 500 r·min-1离心10 min，取血清分装至EP管，采用自动生化仪测定血清TC、TG和LDL-C。

光镜观察颈动脉形态学变化：将4%多聚甲醛溶液中固定的标本取出，进行脱水、石蜡包埋切片、脱蜡，PBS冲洗，苏木素液浸染2 min，流水冲洗，0.3%盐酸乙醇分化，自来水返蓝，伊红染液4 min，封片，光镜下观察。

酶联免疫吸附(ELISA)法检测动脉壁去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)含量：取出冻存标本，于预冷的PBS液中纵向剖开血管，剥离外膜吸干称重，以1 ∶9的比例与生理盐水制成10%的组织匀浆，以3 000 r·min-1离心15 min，取上清液，按照ELISA试剂盒说明进行操作，根据标准曲线推算组织匀浆浓度。

免疫组化检测颈动脉壁交感神经神经生长因子(nerve growth factor,NGF), 酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)分布与表达：将4%多聚甲醛溶液中固定的标本取出，进行脱水、石蜡包埋，制成4 μm厚切片，采用免疫组化SP法，脱蜡至水，抗原修复，3% H2O2孵育，血清封闭，滴加一抗、二抗，PBS液作为阴性对照，DAB显色，封片。以镜下出现棕黄色颗粒为阳性标准，无论是孤立的还是多个紧密排列的细胞团，只要与邻近细胞和周围结缔组织分界清楚即可。

Western blot测定颈动脉壁NGF、TH蛋白表达：取出冻存标本，于预冷的PBS液中纵向剖开血管，剥离外膜吸干称重；取100mg标本加入细胞裂解液，充分裂解后进行蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，待结束后，将凝胶半干转膜至PVDF膜上；封闭液封闭后，分别与NGF, TH抗体4℃孵育过夜；室温洗膜，与稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，洗膜后，抗体结合区带用化学发光法检测。以GADPH为内参，以目的基因吸光度值/GADPH吸光度值的比值作为所检测标本目的蛋白的相对含量，进行数据统计分析。

2　结果

2.1各组血脂水平变化与正常组比较，高脂组和复合模型组血清TC、 TG、 LDL-C水平均明显升高(P<0.01)；高脂组和复合模型组两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。各药物干预组均有一定程度降脂作用，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.01)；药物干预组之间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)，见Tab 1。

Tab 1　Changes of blood lipids of rabbit in different ±s,n=6)

##P<0.01vsnormal;**P<0.01vscomplex model

2.2颈动脉形态学变化正常组内膜光滑完整呈波浪状，内皮细胞结构完整，平滑肌细胞排列整齐；高脂组内膜增生，中膜间隙增宽，外膜微血管数量增多；模型组内膜层弥漫性增生，可见少量泡沫状巨噬细胞形成，中膜间隙增宽，平滑肌细胞和弹力纤维排列紊乱，外膜滋养血管丰富；各药物干预组内膜层增厚程度及外膜滋养血管数量较模型组均有明显改善，见Fig 1。

Fig 1　Appearance of carotid artery morphology in all groups(HE staining×400)

A:Normal;B:High-fat;C:Complex model;D:GSTL-H;E:GSTL-L;F:ATO

2.3各组动脉壁去甲肾上腺素(NE)含量变化与正常组比较，高脂组和复合模型组动脉壁NE分泌水平均明显升高(P<0.01)；高脂组和复合模型组两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。各药物干预组NE分泌量均有不同程度减少，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；药物干预组之间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)，见Tab 2。

GroupDose/mg·kg-1·d-1NE/ng·L-1Normal39．17±7．17High⁃fat75．16±12．31##Complexmodel84．86±14．73##GSTL⁃H60056．61±14．01∗∗GSTL⁃L30071．02±12．31∗∗ATO2．550．80±8．87∗∗

##P<0.01vsnormal;**P<0.01vscomplex model

2.4各组颈动脉壁NGF、TH分布变化与正常组相比，高脂组和复合模型组的颈动脉中膜-外膜区域NGF、TH抗体染色阳性表达增多，与复合模型组比较，桂芍通络高剂量组、桂芍通络低剂量组和阿托伐他汀组均能减少颈动脉中膜-外膜区域分布的NGF、TH蛋白表达量，见Fig 2,3。

Tab 3　Expression of NGF and TH protein in adventitia of common carotid artery in various ±s，n=3)

##P<0.01vsnormal;△△P<0.01vsHigh-fat;**P<0.01vscomplex model

Fig 2　Appearance of NGF in carotid arterial adventitia in various groups(×400,IHC)

A:Normal;B:High-fat;C:Complex model;D:GSTL-H;E:GSTL-L;F:ATO

Fig 3　Appearance of TH in carotid arterial adventitia in various groups(×400，IHC)

A:Normal;B:High-fat;C:Complex model;D:GSTL-H;E:GSTL-L;F:ATO

2.5各组颈动脉壁NGF、TH蛋白表达变化与正常组比较，高脂组NGF、 TH蛋白表达量上调(P<0.01)；与高脂组比较，复合模型组NGF、TH蛋白表达量明显上调，差异有统计学意义(P<0.01)；与复合模型组比较，桂芍通络高剂量组、桂芍通络低剂量组和阿托伐他汀组明显下调NGF、TH蛋白表达量(P<0.01)，各用药组间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)，见Fig 4。

Fig 4　Expression of NGF and TH protein in adventitia of common carotid artery in various groups

A:Normal;B:High-fat;C:Complex model;D:GSTL-H;E:GSTL-L;F:ATO

3　讨论

新西兰兔对外源性胆固醇吸收率高，是最常用制备AS早期高脂血症模型的动物[8]。实施硅胶管包裹术损伤外膜能够维持血管内皮结构与功能的完整性，具有成模迅速、易操作、伤害小等优点。据此，本实验以新西兰兔为对象，采用高脂饮食喂养损伤血管内皮建立高脂血症模型，以高脂饮食叠加右侧颈动脉硅胶管包裹术损伤外膜建立复合模型。本研究结果显示，高脂组和复合模型组TC、TG、LDL-C水平升高，与人类AS早期病变类型是一致的，而复合模型组内膜弥漫性增生，可见少量泡沫状巨噬细胞，脂质条纹形成，损伤程度较高脂组更重。

研究发现[9]，大、中动脉中膜-外膜区域主要分布去甲肾上腺素能神经纤维，这一神经纤维分布特点与AS病变好发部位特征相吻合，提示血管中膜-外膜区域的交感神经可能参与AS早期病变发生发展。在移植静脉动脉化实验[10]中，移植血管外膜神经增生，中-外膜区域神经分布密度下降，交感神经在外膜的分布占相对优势，称为神经重构现象，且进一步的研究证明抑制神经重构后能够明显抑制内膜增生。神经生长因子(NGF)是公认的神经营养因子，由神经元和许多非神经细胞如炎症细胞、平滑肌细胞及免疫细胞分泌，其在靶器官中的合成水平支配交感神经密度[11]，对神经元具有存活、分化、营养成熟、修复等作用。心肌梗死研究[12]中也显示，敲除NGF基因单拷贝后交感神经密度下降了50%。酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)是儿茶酚胺生物合成的限速酶，交感神经分布情况的特异性标记物。本研究结果中，复合模型组NGF, TH蛋白表达上调，提示外膜受损的局部外环境诱发NGF高表达，神经修复过程中神经递质释放，上调交感神经蛋白表达。

“营卫通络方”-桂芍通络是以脉络学说和营卫理论为指导[6]，撷取东汉张仲景调和营卫用药经验研制而成的，以桂枝与白芍为基础方，一通卫阳，一理营阴，合以薤白疏畅营卫气机运行以防络气郁滞，以达营卫畅达，气血流行；辅以丹参、姜黄活血通络，剔除络中淤血。他汀类药物能够通过保护血管内皮、抗炎、抗氧化及调脂发挥抗AS病变的作用[13]。本研究结果显示，桂芍通络能够抑制内膜增生，能降低血清TC、TG和LDL-C水平，且能下调动脉壁NGF、TH蛋白表达及去甲肾上腺素NE的分泌量。其中，桂芍通络高剂量与阿托伐他汀疗效相当，提示桂芍通络能够延缓AS病程进展，其具体机制可能与抑制血管壁交感神经反应性升高有关。

综上所述，外膜受损的局部环境诱发血管壁神经递质释放，交感神经蛋白表达反应性升高，参与AS病程进展，“营卫通络方”-桂芍通络能够有效调节AS早期外膜损伤后的交感神经表达，对血脂也有一定程度调节作用，从而抑制AS病程进展，反证脉络学说和营卫理论在AS病变中的指导作用。

(本实验于河北省络病重点实验室完成。)

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Influence of “Ying-nutrient and Wei-defense unblocking collaterals prescription”on carotid sympathetic nerve in early atherosclerosis

YIN Yu-jie1,2,3，MA Liu-yi4，JIA Zhen-hua1,2,3，ZHANG Jun-fang2, WANG Hong-tao2, SHAN Xing-ge2,LIU Huan2

(1.HebeiUniversityofChineseMedicine,Shijiazhuang050090,China; 2.DeptofCardiology,YilingMedicalInstituteofHebeiProvince,Shijiazhuang050035，China;3.YilingHospitalofHebeiUniversityofChineseMedicine,Shijiazhuang050091，China;4.HebeiProvinceCangzhouHospitalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine,CangzhouHebei130900,China)

AimTo observe the effect of“Ying-nutrient and Wei-defense unblocking collaterals prescription” on the carotid sympathetic nerve in early atherosclerosis.MethodsThe rabbits were randomly divided into 6 groups:Control group, high-fat group, Complex model group, GSTL-H group, GSTL-L group and ATO group. The control group was fed with common foodstuffs, High-fat group with high-fat diet to build early atherosclerosis model, and all the other groups with high-fat diet combined with carotid artery cannula to build early atherosclerosis carotid artery injury rabbit model. All groups were given corresponding medicines intragastrically once a day for 4 weeks.The GSTL-H and GSTL-L group was given Guishaotongluo ultrafine powder 0.6 g·kg-1·d-1, 0.3 g·kg-1·d-1, and the ATO group was given suspension of atorvastain solution 2.5 mg·kg-1·d-1. Biochemical method was used to detect blood lipid change. HE staining was applied to observe the pathological morphology of intima-media, The content of NE in the carotid arterial was detected by ELISA. The immunohistochemical staining was used to detect the protein expression of NGF, TH around the carotid arterial. The expression of NGF, TH in the carotid artery adventitia was detected by Western blot.ResultsCompared with normal group, the levels of TC,TG and LDL-C in high-fat group and complex model group were significantly increased(P<0.01). The degree of the intimal hyperplasia,the content of NE and sympathetic density(NGF, TH protein expression and distribution) of the cartoid artery in complex model group were heavier compared with those in high-fat group; the lipid levels, degree of the intimal hyperplasia and sympathetic density(NGF, TH protein expression and distribution) in the GSTL-H，GSTL-L group were milder in varying degrees comparing with those in the complex model group(P<0.05,P<0.01).Conclusion“Ying-nutrient and Wei-defense unblocking collaterals prescription” can reduce rabbit carotid atherosclerosis, and the mechanism may be related to regulating the sympathetic nerve of arterial wall.

atherosclerosis; adventitia; Ying-nutrient and Wei-defense unblocking collaterals prescription; Guishaotongluo; atorvastatin; sympathetic nerve; nerve modulation

时间：2016-9-22 11:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160922.1114.050.html

2016-06-20；

2016-08-11

国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(No 2012CB518606)； 河北省杰出青年科学基金项目(No H2015106063)

尹玉洁(1989-),女,博士,研究方向：中西医结合心脑血管病，E-mail:963895141@qq.com；

贾振华(1975-),男,教授，博士生导师,研究方向：中西医结合心脑血管病，通讯作者，E-mail:jiatcm@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.10.025

A

1001-1978(2016)10-1463-05

R-332；R289.5；R322.12；R322.85；R338.7；R543.305