冷冻保护剂添加-去除过程对猪M II期卵母细胞损伤研究

杨云周新丽戴建军张德福邵文琪衣星越陶乐仁

（1上海理工大学生物热科学研究所 上海 200093；2上海市农业科学院畜牧兽医研究所 上海 201106）

冷冻保护剂添加-去除过程对猪M II期卵母细胞损伤研究

杨云1周新丽1戴建军2张德福2邵文琪1衣星越1陶乐仁1

（1上海理工大学生物热科学研究所 上海 200093；2上海市农业科学院畜牧兽医研究所 上海 201106）

在卵母细胞的低温保存过程中，冷冻保护剂的添加与去除是一个必不可少的步骤，但高浓度的冷冻保护剂会对细胞造成渗透损伤和毒性损伤。为研究冷冻保护剂添加与去除过程对猪MII期卵母细胞的损伤，本文采用传统的方法（一步法、两步法）来添加和去除冷冻保护剂，探究冷冻液、解冻液、稀释液对细胞存活率的影响。实验结果表明:在冷冻保护剂添加-去除过程中，卵母细胞的渗透损伤主要发生在卵母细胞从冷冻液转移至解冻液，以及保护剂去除阶段；解冻液浓度与平衡时间对卵母细胞存活率有很大影响；卵母细胞保护剂的去除与添加过程是相关的，解冻液浓度和平衡时间的选择依赖于细胞在冷冻液中的浓度和平衡时间。此研究结果将为猪MII期卵母细胞的低温保存方案提供参考。

低温保存；冷冻保护剂；渗透损伤；卵母细胞

自从1986年Chen C［1］首次成功地冷冻保存人的卵母细胞并受精后获得后代以来，卵母细胞的低温保存一直是低温生物医学界的热点课题，该技术的发展在人类辅助生殖及生物胚胎技术领域有着广阔的应用前景［2-3］。卵母细胞的低温保存方法主要有两种:慢速冷冻和玻璃化冷冻。近年来，学术界一致认为玻璃化冷冻效果明显优于慢速冷冻，因为玻璃化冷冻是高浓度冷冻保护剂溶液在超快速冻结过程中形成一种介于液态和固态之间的、透明的、非晶态物质的过程，避免了细胞内外冰晶的产生［4-5］。为了实现卵母细胞的玻璃化冷冻，研究学者提出了微滴喷射法［6］、开放式麦管法、冷冻环法［7］、Cryotop法［8-9］等多种提高降温速率的方法。尽管如此，目前临床上卵母细胞解冻复温后的存活率、受精率、胚胎率及分娩率依然很低。Kuwayama M等［10］报道了Cryotop法玻璃化冷冻111个人MII期卵母细胞，获得活胚分娩的机率仅为10%左右。

影响卵母细胞玻璃化冷冻效果的因素有很多，除了冷冻载体、升降温速率等，冷冻保护剂的使用所带来的副作用也是一个重要的因素。在冷冻保护剂添加与去除过程中，由于胞外渗透压的急剧变化，大量水或保护剂快速流出或流入细胞，从而引起细胞体积的收缩或膨胀，造成细胞膜结构的损伤；同时冷冻保护剂自身的化学毒性，会对卵母细胞造成毒性损伤［11］。为了减小保护剂渗透作用和化学毒性对卵母细胞的损伤，目前通常采用分步添加和分步去除保护剂的方法。Mullen S F等［12］研究表明分步法向人卵母细胞导入6.4 mol/L乙二醇（EG）时，以四步添加最为理想。解政鼎等［13］认为添加高浓度低温保护剂时，采用等渗透压差、渗透时间间隔逐渐减小的分步添加方法，可以减轻细胞的渗透损伤和毒性损伤。前人研究的侧重点在于保护剂添加-去除程序的优化，而对于分步添加-去除过程中每一步对细胞的损伤程度有多大，并没有定量的数据，从而不能准确地了解细胞渗透损伤发生在哪个阶段；此外，上述研究多是孤立地优化添加过程或去除过程，而事实上，保护剂去除过程中稀释液浓度与平衡时间的选择都依赖于保护剂加载过程（冷冻液浓度、平衡时间），保护剂的加载过程与去除过程需要相匹配。

本研究首先采用一步法、两步法对猪MII期卵母细胞进行冷冻保护剂的添加与去除，逐步分析加载-去除过程中每一步对细胞存活率的影响，对渗透损伤发生在哪个阶段有更准确的认识。然后对两步法中渗透损伤明显的阶段进行优化，讨论冷冻液浓度、稀释液浓度、以及平衡时间等因素对细胞存活率与发育率的影响，进一步说明细胞保护剂添加过程与去除过程的相关性。

1　材料与方法

1.1主要试剂

组织 培 养 液 （tissueculturemedium199，TCM199）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，Me2SO）、蔗糖，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Gibco公司，美国。实验中所用其他试剂除特别说明外，均购自美国Sigma公司。

1.2玻璃化冷冻液、解冻液、稀释液

一步法:基础液:TCM199+20%FBS；玻璃化冷冻液（vitrification solution，VS2）:基础液 +30% （v/ v）Me2SO；解冻液（thawing solution，TS）:基础液+ 0.5 mol/L蔗糖；稀释液（dilution solution，DS2）:基础液。两步法:基础液:TCM199+20%FBS；玻璃化冷冻液1（VS1）:基础液 +15% （v/v）Me2SO；玻璃化冷冻液2（VS2）:基础液 +30% （v/v）Me2SO+0.5 mol/L蔗糖；解冻液（TS）:基础液+0.5 mol/L蔗糖；稀释液1（DS1）:基础液 +0.25mol/L蔗糖；稀释液2（DS2）:基础液。

1.3猪卵母细胞的采集与体外成熟

实验中所用的猪卵母细胞取自上海市嘉定区某屠宰场采集的新鲜卵巢，放在37℃的保温杯中1 h内运回实验室，选择卵巢表面直径为2～6 mm的卵泡，用10 mL的一次性注射器将卵母细胞复合体连同卵泡液一起吸出。将抽出的液体置于10 mL的离心管中，在39.5℃的恒温水浴中静置15～20 min，移除上清液。取胞质均匀且有3层以上致密卵丘细胞包裹的细胞，即GV期卵母细胞。

将GV期卵母细胞在TCM199中洗涤三次后，置于已经平衡4 h以上的成熟培养液中，成熟液是TCM199+10%FBS+10%猪卵泡液 +0.1%孕马血清促性腺激素（PMSG）+0.1%人体毛膜促性腺激素（hCG），然后再放入CO2培养箱（39±0.5℃、5%CO2，BC-J160S，上海博讯实业有限公司，中国）中，成熟培养44～46 h，得到MII期卵母细胞。MII期卵母细胞用0.1%透明质酸酶消化以去除卵丘细胞，再用TCM199洗涤3～5次，备用。

1.4玻璃化冷冻液、解冻液、稀释液的渗透压测定

室温下，每次取已配制好的玻璃化冷冻液、解冻液、稀释液200～250μL，放入渗透压计（Model-3250冰点渗透压计:Advanced，美国）的检测管内测量其渗透压。每组溶液重复测量3次，取其平均值。

1.5细胞渗透损伤的逐步确定

为了准确了解细胞渗透损伤发生在哪个阶段，实验组卵母细胞依次经过不同溶液，每转移一次，检测一次细胞存活率。每组所用卵母细胞个数约为60个，每组实验重复2～3次。对照组:新鲜细胞，不经过任何处理。一步法:将卵母细胞从基础液中移至玻璃化冷冻液中平衡1 min，完成冷冻保护剂的加载。接着将卵母细胞移至解冻液中，浸没时间3min，然后移至37℃的基础液中，浸没时间6 min，完成保护剂的去除。两步法:将卵母细胞从基础液中移至VS1中，平衡时间3 min，然后快速转移至VS2中，平衡时间30 s，完成保护剂的加载。接着将卵母细胞移至TS中，浸没时间3 min，然后移至DS1中，浸没时间3 min，然后再放入DS2中，平衡时间3 min。逐级脱除冷冻保护剂。

1.6两步法解冻液浓度与平衡时间的优化确定

采用两步法添加保护剂后，选择不同浓度的解冻液以及在其中的平衡时间，卵母细胞的存活率会有较大差异。为了选择合适的解冻液浓度和平衡时间，进行如下实验:首先将卵母细胞按照1.5中的两步法完成冷冻保护剂的添加，然后将卵母细胞分别转移至含0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L四种不同浓度蔗糖的解冻液中，每种浓度解冻液中停留60 s、120 s、180 s三个平衡时间，从解冻液中取出后，检测细胞的存活率。

1.7两步法去除与添加过程的优化匹配

卵母细胞在玻璃化溶液中平衡不同的时间后，其所对应的优化解冻条件也会有所改变。为了探讨添加过程和去除过程之间的匹配关系，进行如下实验:将卵母细胞从基础液中移至VS1中平衡3 min，然后快速转移至VS2中，平衡时间分别为30 s、45 s、60 s、90 s、120 s、180 s，接着将细胞快速转移至含0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L四种不同浓度蔗糖的解冻液中，平衡时间120 s，从解冻液中取出后，检测卵母细胞的存活率。

1.8细胞存活率的判断

卵母细胞经过不同处理后，立即用荧光素双醋酸酯（fluorescein diacetate，FDA）染色 5 min，再用TCM199洗涤3～4次，在倒置荧光显微镜（TS100倒置荧光显微镜:Nikon，日本）下观察是否着色。有强荧光反应的细胞认为是活卵，无荧光反应或弱荧光反应的细胞认为是死卵。活卵数与细胞总数之比为细胞存活率，以此标准计算卵母细胞存活率。实验数据采用数据分析软件SPSSStatistics13.0进行显著性分析，p＜0.05为显著性差异标准。

2　实验结果与讨论

2.1所用溶液的渗透压

一步法与两步法所用冷冻液、解冻液、及稀释液的渗透压值如表1所示。从表中可以看出，玻璃化冷冻液的渗透压值远大于解冻液与稀释液，两种方法中，玻璃化冷冻液VS2与解冻液之间的渗透压差均达到了 5 000 mOsm/kg左右。含 0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L四种不同浓度的蔗糖解冻液的渗透压值如表2所示，溶液的渗透压随着蔗糖浓度的增加而增加，形成渗透压梯度。

2.2保护剂添加与去除过程对卵母细胞存活率的影响

为了对渗透损伤发生在哪个阶段有更准确的认识，将卵母细胞依次经过玻璃化冷冻液、解冻液、稀释液的处理，探究每一步对细胞存活率的影响，结果如图1所示。从图1（a）可知，卵母细胞经一步法添加30%Me2SO后，细胞的存活率为83.9%，显著低于对照组的95.2%。细胞不经过冷冻保存，然后经过解冻液和稀释液处理后，细胞的存活率分别为58.4%、58.7%。从图1（b）可知，卵母细胞经两步法添加冷冻保护剂，每一步添加后的细胞存活率分别为91.9%、92.1%，较对照组的98.5%有所降低。然后卵母细胞从冷冻液VS2中转移至解冻液中，细胞存活率减小至84.0%，再经稀释液WS1、WS2去除保护剂后，细胞存活率有显著减小，分别为 74.2%和69.8%。

表1　一步法和两步法所用溶液的渗透压值/（mOsm/kg）Tab.1 The osmotic p ressure values of the solutions used in one-step method and two-step m ethod

与一步法相比，两步法处理增加了卵母细胞冷冻保护剂添加与去除的步数，缩小了溶液间的渗透压差，从而减轻了溶液对细胞的渗透损伤，有利于细胞的冷冻保存。此外，对于一步法和两步法来说，卵母细胞从冷冻液转移至解冻液，以及冷冻保护剂去除的过程中，细胞的存活率会显著降低，说明溶液对卵母细胞的渗透损伤主要发生在这个阶段，这是因为细胞从冷冻液转移至解冻液中，细胞内外出现了极大的渗透压差，使得溶液跨膜扩散具有了更大的驱动力，导致大量水或冷冻保护剂快速流出/流入细胞，从而引起细胞体积的膨胀或收缩，对细胞造成致命的渗透损伤［13］。

对于冷冻保护剂的添加过程，研究者已经做了大量的优化研究，包括保护剂浓度、添加步骤、每一步的时间等［14-15］。然而，Wang L等［16］和Liu J等［17］对冷冻保护剂添加和去除的全过程进行了研究，结果表明:冷冻保护剂的去除过程对细胞的渗透损伤要远大于其他步骤，缩短冷冻保护剂的去除程序可能会减小细胞的渗透损伤。这与文中的实验结果是一致的。

图1　一步法、两步法添加与去除保护剂对猪卵母细胞存活率的影响Fig.1 Effect of addition and rem oval of CPA w ith one-step method and two-step method onsurvival rate of porcine oocytes

2.3解冻液浓度与平衡时间对猪卵母细胞存活率的影响

以两步法添加冷冻保护剂，然后将卵母细胞从冷冻液VS2中分别转移至0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L四种不同浓度的蔗糖解冻液中，平衡时间分别为60 s、120 s、180 s，细胞的存活率如图2所示。从图中可以看出，解冻液浓度与平衡时间都对卵母细胞存活率有很大影响，卵母细胞在四种不同浓度解冻液中暴露60 s的细胞存活率均显著低于暴露120 s和180 s，这是因为细胞在溶解液中平衡时间短，胞内外未达到渗透平衡状态，细胞仍处于膨胀状态，此时胞内保护剂未能充分去除，高浓度保护剂对细胞有毒性损伤。卵母细胞在解冻液中暴露180 s的存活率要低于120 s，但两者之间无显著性差异。

从图中还可以看出，浓度为1 mol/L的解冻液处理后细胞存活率要高于其他实验组。根据之前测得的溶液渗透压值可知，浓度为0.5、1.0、1.5、2.0 mol/ L的解冻液与VS2之间的渗透压差分别是5 198、4 207、3 619、3 339 mOsm/kg，说明并不是冷冻液VS2与解冻液间的渗透压差越小，细胞的存活率就越高。这可能与低温保护剂的加载过程有关，卵母细胞在VS2中仅平衡30 s，细胞内渗透压远没有达到与VS2平衡的渗透压5 867 mOsm/kg，可能与1 mol/L的蔗糖溶液的渗透压1 660 mOsm/kg接近。当细胞被转移至不同浓度的解冻液中时，与细胞内渗透压最接近的解冻液，对细胞损伤最小。在本实验中，当解冻液浓度为1 mol/L，平衡时间为120 s时，卵母细胞存活率最高，达到80.6%。

图2　解冻液浓度与平衡时间对猪卵母细胞存活率的影响Fig.2 Effect of concentration of thaw ing solution and equilibration time on survival rate of porcine oocytes

2.4保护剂添加过程与去除过程的相关性

采用两步法添加冷冻保护剂，并将卵母细胞在冷冻液VS2中分别平衡30 s、45 s、60 s、90 s、120 s、180 s，然后转移至0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L四种浓度的解冻液中平衡120 s，卵母细胞的存活率如图3所示。从图中可以看出，当卵母细胞在VS2中平衡时间为30 s时，解冻液浓度为1 mol/L处理的细胞存活率最高，2 mol/L处理的细胞存活率最低；当卵母细胞在VS2中平衡时间为45 s、60 s、90 s、120 s、180 s时，解冻液浓度为2 mol/L和1.5 mol/L处理的细胞存活率较高。说明卵母细胞在玻璃化溶液中的平衡时间改变后，其所对应的解冻液条件也随之发生变化。细胞在冷冻液VS2中平衡时间短，应选择低浓度的解冻液；反之，则选择高浓度的解冻液。这可能是因为细胞内保护剂的渗透压随着平衡时间的延长而增加，增加解冻液浓度可以减小渗透压差，从而提高细胞存活率［16］。Wang X等［18］对牛卵母细胞进行了冷冻保护剂的分步添加和去除实验，结果表明四步添加结合两步去除的方案后细胞的卵裂率和囊胚率最高，说明冷冻保护剂的去除与添加过程是相关的，两者之间需要相匹配。此外，当卵母细胞在VS2中平衡时间大于60 s时，所有浓度解冻液处理后的细胞存活率都随着平衡时间的增加而减小，说明细胞在高浓度冷冻液中的渗透损伤和毒性损伤很大，平衡时间不宜超过60 s。

图3　解冻液浓度与猪卵母细胞在VS2中平衡时间的依赖关系Fig.3 The dependency between the concentration of thaw ing solution and the equilibration time in VS2to porcine oocytes

3　结论与展望

为了研究冷冻保护剂添加与去除过程对猪MII期卵母细胞的损伤，采用了一步法和两步法添加和去除冷冻保护剂，探究了冷冻液、解冻液、稀释液对细胞存活率的影响。在冷冻保护剂添加和去除过程中，各溶液之间的渗透压差是导致细胞损伤的重要因素，其中溶液渗透损伤主要发生在细胞从玻璃化溶液转移至解冻液，以及冷冻保护剂去除过程中。目前分步法是去除保护剂的常用方法，但卵母细胞保护剂的去除过程与加载过程是相关的，解冻液浓度和平衡时间的选择依赖于细胞在冷冻液中的浓度和平衡时间。尽管优化后的分步法减小了细胞的渗透损伤，但仍然无法避免细胞体积的骤变，而且实际操作的规范性不好掌握，实验重复性差。为了弥补这些缺点，提高卵母细胞低温保存效果，微流体法能实现冷冻保护剂的连续性去除，可能是一种有效的去除方法。

本文受上海市自然科学基金（13ZR1429200）和上海市国家重点实验室（1N15301101）项目资助。（The projectwas supported by the Natural Science Foundation of Shanghai（No. 13ZR1429200）and the National Key Laboratory of Shanghai（No. 1N15301101）.）

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Zhou Xinli，female，associate professor，Institute of Biothermal Technology，University of Shanghai for Science and Technology，+86 21-55270218，E-mail:zjulily@163.com.Research fields: cryopreservation of biomaterials.The author takes on project supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 51376132）:theoretical and experimental research on oocyte cryopreservation in microfluidic device.

Study on Injuries of Porcine M II-stage Oocytes during Cryoprotectants Addition and Removal Processes

Yang Yun1Zhou Xinli1Dai Jianjun2Zhang Defu2ShaoWenqi1Yi Xingyue1Tao Leren1

（1.Institute of Biothermal Technology，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai，200093，China；2.Animal and Veterinary Research Institute，SAAS，Shanghai，201106，China）

Cryoprotectants addition and removal are essential steps during oocytes cryopreservation，however，high concentration of cryoprotectantsmay cause osmotic and toxic injuries to oocytes.In order to study the injuries of porcine MII-stage oocytes during cryoprotectants addition and removal processes，cryoprotectantwas loaded and unloaded to/from oocytes with traditionalmethods（one-step method，two-step method），the effects of vitrification solution，thawing solution and dilution solution on the survival rate of oocyteswere investigated.The experimental results showed that the osmotic injuries to oocytes happenedmainly in two stages:the transfer process from vitrification solution to thawing solution，and the cryoprotectants removal process.The concentration of thawing solution and equilibrium time had a great influence on the survival rate of oocytes.The cryoprotectants removal processwas highly correlated with addition process，and the selection of thawing solution concentration and equilibrium time relied on the vitrification solution concentration and equilibrium time. These results could provide a reference for cryopreservation protocols of porcine MII-stage oocytes.

cryopreservation；cryoprotectants；osmotic injury；oocyte

About the

TB61+1；R318.52；Q27

A

0253-4339（2016）05-0106-06

10.3969/j.issn.0253-4339.2016.05.106

国家自然科学基金（51376132）资助项目。（The project was supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 51376132）.）

2016年1月18日

简介

周新丽，女，副教授，上海理工大学生物热科学研究所，（021）55270218，E-mail:zjulily@163.com。研究方向:生物材料的低温保存。现在进行的项目有:国家自然科学基金项目（51376132）——卵母细胞微流体低温保存过程的理论与实验研究。