微生物絮凝剂产生菌J-1的生长发酵动力学模型

邢　洁，李立欣，王　强，马　放

(1.黑龙江省环境科学研究院，哈尔滨 150056; 2.黑龙江科技大学 环境与化工学院，哈尔滨 150022；3.哈尔滨工业大学 城市水资源与水环境国家重点实验室，哈尔滨 150090)



微生物絮凝剂产生菌J-1的生长发酵动力学模型

邢洁1，李立欣2，王强1，马放3

(1.黑龙江省环境科学研究院，哈尔滨 150056; 2.黑龙江科技大学 环境与化工学院，哈尔滨 150022；3.哈尔滨工业大学 城市水资源与水环境国家重点实验室，哈尔滨 150090)

为提高微生物絮凝剂的产量，选取自主筛选的优势菌种克雷伯氏菌J-1，研究其生长发酵过程，探索菌体生长与产物生成之间的内在规律,得到产絮菌J-1的生长动力学模型及其产物生成动力学模型。结果表明：产絮菌J-1代谢产物的生成与其菌体总量相关，保证充足的营养和生物量，微生物絮凝剂的合成速率得到有效提高。当产絮菌J-1发酵至15 h时，絮凝率最高为94.97%。

微生物絮凝剂； 产絮菌； 生长动力学； 产物生成动力学

0　引　言

2015年，国务院正式发布《水污染防治行动计划》，系统推进水污染防治、水生态保护和水资源管理。这意味着我国水污染现状和水资源保护工作已经引起政府与公众的高度重视。水污染防治的严峻形势对水处理技术提出了新的要求，其绿色化进程将被提速。开发功能齐备、环境友好、可持续发展的绿色水处理剂，已经成为水污染处理领域的研究热点。絮凝剂是水处理剂中最常用的一种药剂，其发展经历了无机低/高分子絮凝剂、有机低/高分子絮凝剂和微生物絮凝剂三大阶段[1]。要达到生产过程和使用过程均绿色化的目标，微生物絮凝剂成为絮凝剂绿色化进程中的主流研究方向。微生物絮凝剂是利用微生物的生长代谢特点，积累有益代谢产物，并对其进行分离提取后获得的产品。整个生产过程安全无毒、无二次污染，可以有效克服无机和有机絮凝剂残留时间长、无法生物降解而对环境造成再次污染的缺点[2]。历经30余年，国内外科研工作者对微生物絮凝剂展开了广泛研究，在菌种资源方面获得显著成果[3]。然而，由于微生物特有的生理周期震荡性和遗传变异性，微生物絮凝剂的发酵尚存在不稳定性[4]，所以，需要不断开发新的高效微生物絮凝剂产生菌(以下简称产絮菌)，来补充完善菌种资源。通过菌体生长动力学来客观地掌握其生理特征，通过产物生成动力学明确产物生成条件，为调控产絮菌的发酵过程，促进微生物絮凝剂生产发酵机械化、智能化，最终提高微生物絮凝剂产率奠定基础。笔者研究的产絮菌J-1为自主筛选的优势菌种克雷伯氏菌(Klebsiella sp．)[5]。为了优化调控产絮菌J-1的发酵过程，扩大微生物絮凝剂的产量，特对产絮菌J-1的生长发酵动力学进行了初步研究。

1　材料与方法

1.1实验材料

菌种：产絮菌J-1是从活性污泥中分离驯化的菌种，经鉴定为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)，菌种保藏号为CGMCC NO.6243。

培养条件：每100 mL发酵培养基中接种6.5 mL产絮菌J-1种子液，pH值为7.5，温度为35 ℃，摇床转速为140 r/min。

培养基：葡萄糖 10.0 g，K2HPO45.0 g，KH2PO42.0 g，NaCl 0.1 g，尿素 0.5 g，Mg(SO4)·7H2O 0.2 g，酵母膏 0.5 g，蒸馏水 1.0 L。调节pH至 7.2～7.5，在112 ℃下灭菌 30 min。

仪器：ZR4-6混凝搅拌仪，青岛明博环保科技有限公司；721可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；ALC-210.4电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；8037-SGS灭菌锅，长春百奥；DH-9053A鼓风干燥箱，上海益恒实验仪器有限公司；ZHWY-211B恒温振荡器，上海智诚分析仪器制造有限公司；ZHJH-1109超净台，上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.2实验方法

生长曲线选用比浊法和干重法测定[6]。

(1)比浊法。产絮菌液体发酵33 h，每3 h取六个平行样，其中三个平行样经无菌水适度稀释，用分光光度计在600 nm波长下测吸光度。

(2)干重法。产絮菌液体发酵33 h，每3 h取六个平行样，其中三个平行样经低温离心，去除上清液，将沉淀干燥至恒重，用电子天平测其重量。

絮凝活性采用絮凝率来评价，使用混凝搅拌法[7]测定。

2　结果与讨论

2.1产絮菌的生长发酵及其絮凝活性

微生物絮凝剂作为产絮菌的发酵代谢产物，其絮凝活性与产絮菌的生长情况有很强的关联性，观测产絮菌J-1在33 h内的生长变化情况，结果见图1。

图1　产絮菌J-1的絮凝活性随其生长状态的变化

Fig.1Change of flocculation activity of J-1 with growth curves state

由图1可知，在0～12 h，产絮菌J-1处于对数生长期，理论上，其絮凝率k应随着菌体的快速生长而逐渐升高，但实际却在0～6 h内出现下降现象。这是由于絮凝剂液体培养基造成的误差[8]。空白培养基具有一定的絮凝效果，随着营养成分供菌体生长而消耗，絮凝率呈下降趋势。6 h后随着菌体生长接近最高值，开始不断分泌代谢产物，絮凝率开始上升。12～27 h内，产絮菌J-1处于稳定期，菌体量保持稳定状态，代谢产物大量积累，在15 h时，菌量积累到最大值为2.05 g/L，絮凝率达到94.97%。21 h后产絮菌J-1处于稳定期后期，培养基提供的营养不足以供给菌体生长，代谢产物的分泌呈减缓趋势。27 h后，部分代谢产物被用来弥补培养基营养成分的缺失，产絮菌J-1进入衰亡期，絮凝率继续下降。综上所述，絮凝率的变化趋势符合产絮菌J-1的生长代谢规律。

为进一步验证产絮菌J-1的絮凝活性与其生长代谢规律的关联性，对发酵15 h的产絮菌J-1传代培养10次，观测其菌浊与絮凝率的变化，见图2。

图2　产絮菌J-1絮凝活性与菌浊的稳定性

Fig.2Stability of flocculation activity and bacteria cloud for flocculating bacteria J-1

由图2可知，传代次数n为10，产絮菌J-1的絮凝率均保持在95%左右，其菌浊也保持在最高水平。这不仅验证了产絮菌J-1的絮凝活性与其生长代谢规律的关联性，同时证明了产絮菌J-1遗传稳定性优良。

2.2产絮菌的生长动力学模型

为更加科学、客观地掌握产絮菌J-1生长变化的内在规律，观测其33 h内的菌量变化规律，选择Logistic方程建立产絮菌J-1的生长动力学模型[9]。

对Logistic方程积分计算后，得到：

(1)

式中：ρ0——初始生物量，g/L，产絮菌J-1的ρ0为0.28 g/L；

ρm——最大生物量，g/L，产絮菌J-1的ρm为2.05 g/L；

K——最大比生长速率，h-1；

t——时间，h；

Y——菌体干重，g/L。

将ρ0和ρm值代入式(1)：

(2)

产絮菌J-1的培养时间t为自变量，菌体干重Y为因变量，进行非线性拟合，结果见图3。

由图3可知，Logistic方程基本可以反映产絮菌J-1的生长变化规律。衰亡期菌量的预测值低于实验值，这是由于实验中菌量的测定采取了菌体干重法，既有活菌又有死菌，而Logistic方程对菌量的预测值为活菌量。两者平均残差为0.008，拟合度R2为0.98。利用该拟合曲线，求得K值为0.441，代入式(2)，获得产絮菌J-1的生长动力学模型：

(3)

图3　生长动力学拟合曲线

产絮菌J-1的比生长速率0.441，高于实验室已有的高效产絮菌的比生长速率0.253[10]，说明产絮菌J-1代时相对较短，为微生物絮凝剂的发酵节约了时间成本。

2.3产絮菌的产物生成动力学模型

图1表明，产絮菌J-1的絮凝活性由其代谢产物确定，且稳定期絮凝率最高，此时菌体生长也达到最高值，比生长速率减缓，菌体生长与产物形成属于部分偶联型，故选取Luedeking-Piret方程进行模拟[9]。

对Luedeking-Piret方程积分计算后，得到：

(4)

式中：α——产物生成常数(关联菌体生长)；

β——产物生成常数(关联菌体量);

P——产物生成量，g/L。

代入K值，有

(5)

产絮菌J-1的培养时间t为自变量，产物生成量P为因变量，进行非线性拟合，结果见图4。

图4　发酵动力学拟合曲线

由图4可知，Luedeking-Piret方程可以较好地反映产絮菌J-1的代谢规律。代谢产物的实验值与预测值的平均残差为0.016，拟合度R2为0.97。利用该拟合曲线，求得α值为1.29，β值为-0.010，代入式(5)，得到产絮菌J-1的产物生成动力学模型：

(6)

当α≠0、β=0时，发酵类型属于生长偶联型；α=0、β≠0时，发酵类型属于非生长偶联型；α≠0、β≠0时，发酵类型属于部分生长偶联型。由式(6)可见，当α值越大，β值越小时，产物生成量越高。再次证明了产絮菌J-1发酵微生物絮凝剂的过程为部分偶联型。

综上所述，菌体生长与产物形成属于部分偶联型，所以产絮菌J-1代谢产物的生成与其菌体总量相关，而与菌体生长关联较小。因此，在微生物絮凝剂大量合成前，若比生长速率较大，保证充足的营养和生物量，菌体快速繁殖，菌体总量大量积累，产絮菌J-1代谢产物的合成速率可以得到有效提高。

3　结　论

(1)产絮菌J-1絮凝活性的变化趋势符合其生长代谢规律。当发酵时间为15 h时，即产絮菌J-1的稳定期，絮凝活性最高为94.97%，且连续传代10次，保持稳定。

(2)利用Logistic方程模拟产絮菌J-1的生长变化规律。实验中菌量测选值与Logistic方程预测值的平均残差为0.008，根据生长动力学拟合曲线，求得K值为0.441，获得产絮菌J-1生长动力学模型。

(3)利用Luedeking-Piret方程可以较好地反映产絮菌J-1的代谢规律。代谢产物实验值与预测值的平均残差为0.016，根据发酵动力学拟合曲线，获得产絮菌J-1的产物生成动力学模型。

[1]易允燕,叶劲松,俞志敏,等.高效絮凝剂产生菌的筛选及培养条件优化研究[J].蚌埠学院学报,2016,5(1):21-26.

[2]周晓铁,韩昭,孙世群，等.微生物絮凝剂的应用研究现状和发展趋势[J].安徽农业科学,2015,43(32):107-108，114.

[3]张海,曲睿娟,李日强.高效絮凝剂产生菌的分离选育及培养条件优化[J].山西农业科学,2016,44(2):222-228.

[4]李静,马放,赵光,等.利用沼液制备微生物絮凝剂及产絮条件优化[J].中国给水排水,2014,30(15):14-19.

[5]邢洁，杨基先，庞长泷，等.生物絮凝剂产生菌的鉴定及EE2的去除效能[J].中国给水排水,2013,29(11):11-14.

[6]邢洁.蛋白型微生物絮凝剂对卡马西平的去除效能和机制解析[D].哈尔滨:哈尔滨工业大学,2014:29-30.

[7]田连生,陈秀清.生物絮凝剂产生菌的人工选育及污水处理试验[J].工业水处理,2016,36(3):47-50.

[8]熊丽娟,杨朝晖,曾光明,等.培养基中磷酸盐在 GA1 所产絮凝剂絮凝中的作用研究[J].环境科学学报,2007,27(7):1157-1162.

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(编辑王冬)

Growth and fermentation kinetics model of bioflocculant producing strain J-1

XING Jie1,LI Lixin2,WANG Qiang1,MA Fang3

(1.Heilongjiang Provincial Research Institute of Environmental Sciences,Harbin 150056,China; 2.School of Environmental &Chemical Engineering,Heilongjiang University of Science &Technology,Harbin 150022,China; 3.State Key Laboratory of Urban Water Resource &Environment,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)

This paper is an attempt to improve the yield of microbial flocculants.The study starting with growth characteristics and flocculation activity of bioflocculant producing strain J-1 works towards the growth and fermentation kinetics of bioflocculant;and the law underlying the association between strain growth and product formation.This results in the growth kinetics model and product formation kinetics model of strain J-1.The results reveal that there is an association between the product formation of bioflocculant producing strain J-1 and the total amount of bacteria;an effective improvement in the synthesis rate of bioflocculant is possible with the presence of adequate nutrition and biomass;and the fermentation time of 15 h ensures the maximum flocculating rate of up to 94.97%.

bioflocculant;bioflocculant producing strain;growth kinetics;product formation kinetics

2016-04-25

水体污染控制与治理科技重大专项(2014ZX07201-012-01)；国家自然科学基金项目(51408200);哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目(2015RQQXJ015)

邢洁(1983-)，女，湖北省广济人，工程师，博士，研究方向：流域水环境，E-mail：18686885851@163.com。

10.3969/j.issn.2095-7262.2016.03.014

X703

2095-7262(2016)03-0300-04

A