人绒毛膜促性腺激素通过上调胶质细胞缺失因子-1介导人滋养细胞胎盘生长因子分泌

赵洪波　李瑞霞　张　炜

(上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室-复旦大学附属妇产科医院　上海　200011)



人绒毛膜促性腺激素通过上调胶质细胞缺失因子-1介导人滋养细胞胎盘生长因子分泌

赵洪波▲ △李瑞霞▲张炜

(上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室-复旦大学附属妇产科医院上海200011)

目的研究人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)对人滋养细胞胶质细胞缺失因子-1(glial cell missing 1,Gcm-1)表达及胎盘生长因子(placental growth factor,PIGF)分泌的调控。方法人绒毛膜癌细胞株Bewo经不同剂量HCG处理后,以实时定量PCR及Western blot法分析检测Gcm-1的表达,以ELISA方法测定PIGF分泌。通过干扰小RNA下调人滋养细胞Gcm-1表达,观察其对HCG调控PIGF分泌的影响。结果HCG以剂量依赖的方式促进人滋养细胞Gcm-1表达及PIGF分泌,而HCG诱导PIGF分泌则由Gcm-1介导。结论HCG通过上调Gcm-1表达促进人滋养细胞PIGF分泌,提示HCG可能是一种对妊高征具有保护作用的因子。

人绒毛膜促性腺激素;滋养细胞;胶质细胞缺失因子-1;胎盘生长因子

妊娠高血压综合征,简称妊高征,是妊娠20周后出现的高血压、水肿、蛋白尿等症状的统称。妊高征发病率约为5%～8%,是导致产妇与围生儿死亡的重要原因之一[1]。然而,妊高征可能涉及的相关分子机制目前并不完全清楚[2-4]。胶质细胞缺失因子-1 (glial cell missing 1,Gcm-1)是主要在胎盘组织表达的转录因子,妊高征孕妇胎盘Gcm-1表达显著下降,提示Gcm-1的表达下降与妊高征发生密切相关[5-6]。Gcm-1调控包括胎盘生长因子(placental growth factor,PIGF)在内的多种蛋白质的水平[5]。而PIGF与早孕期胎盘血管形成密切相关,妊高征孕妇PIGF的水平较正常孕妇显著下降,且PIGF水平越低妊高征孕妇症状愈严重,而恢复PIGF水平则显著缓解妊高征孕妇的症状,提示恢复PIGF水平可能是妊高征重要的治疗措施[5,7-9]。

近期有研究发现,人绒毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)以正反馈的方式促进Gcm-1基因表达[10],然而HCG是否通过Gcm-1调控PIGF水平目前并无报道及深入研究。 因此本文拟利用人滋养细胞株分析HCG对PIGF基因的表达调控及其分子机制,从而为提出妊高征治疗策略提供新的理论依据。

材 料 和 方 法

细胞培养人绒毛膜癌细胞株Bewo购自美国美国菌种保藏中心(ATCC)细胞库,细胞培养使用加入青霉素和链霉素的含10%胎牛血清的DMEM/Ham’s F12 培养液(美国GIBCO公司,中国杭州吉诺生物技术有限公司分装)。培养条件:培养皿置于37 ℃、5% CO2的培养箱,每2～3天换液一次。细胞传代使用0.25 %胰蛋白酶消化,按1∶3或1∶4的细胞比例传代。

试剂PIGF细胞因子ELISA检测试剂盒购于美国R&D公司;HCG购于美国Sigma公司;人Gcm-1小干扰RNA(siRNA):5′-AACTCCCGCA-TCCTCAAGAAG-3′和5′-AACCTACAGTAGTG-GAG-ACCT-3′,非特异干扰siRNA (NS siRNA):5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′,购自德国Qiagen公司。小鼠抗人Gcm-1抗体购自于英国Abcam公司,使用浓度按1∶1 000稀释。小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购自美国Santa Cruz公司,使用浓度按1∶2 000稀释。标记辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG二抗购自上海康成生物公司。

RNA抽提及实时定量RT-PCRBewo细胞经HCG处理48 h后加入TRIzol裂解液(美国Invitrogen 公司),静置5 min后于4 ℃下12 000×g离心10 min(下同),上清中加入氯仿,充分混匀后离心,转移水相至离心管加入等体积异丙醇,离心后取沉淀并加入75%乙醇,再离心取沉淀于室温静置5 min,以使RNA沉淀充分干燥。用无菌水溶解抽提物的样品浓度,测定在260 nm和280 nm波长下的吸光度值(D),确定RNA含量。取0.5 μg的RNA加入5 ×PrimeScriptTMRT Master Mix (实时定量PCR) 37 ℃下15 min,85 ℃下5 s,将其逆转录为cDNA。PCR反应以上述的逆转录产物为模板,利用SYBR Premix Ex TaqII (实时定量PCR) 进行定量PCR。扩增条件:94 ℃预变性5 min、94 ℃30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃ 30 s、72 ℃延伸45 s。Gcm-1及 GAPDH引物序列如下:Gcm-1正义链,5′-GCCATGCGCAAT-ACCAACAA-3′,Gcm-1反义链,5′-TCACAGTTGGGACAG-CGTTT-3′;GAPDH正义链,5′-GCCGCTTC-TTCTCGTGCAG-3′,GAPDH反义链,5′-ATGGATCATTGATGGC-GACAACAT-3′。Gcm-1和GAPDH的PCR扩增产物长度分别是:144 bps和173 bps。

细胞转染使用阳离子脂质体LipofectamineTM2000 (美国Invitrogen公司)试剂进行转染。将对数生长期细胞2×105个接种到6孔板中,培养24 h 以使转染时细胞融合达到30%～50%。分别平行配制转染试剂Lipofectamine的无血清DMEM/Ham’s F12稀释液(每孔250 μL无血清DMEM/Ham’s F12和10 μL Lipofectamine)和重组质粒的无血清稀释液(在250 μL无血清DMEM/Ham′s F12中加入4 μg siRNA),室温静置,5 min内混合上述两管液体,室温静置20 min形成DNA-Lipofectamine复合物,并将DNA-Lipofectamine复合物加入培养细胞中。37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育8 h后,更换新鲜培液。转染48 h,收集细胞进行Western blot蛋白质印迹及ELISA测定实验。

ELISA测定Bewo细胞接种于6孔板,以无血清培养液处理8 h,随后加入HCG或转染小干扰RNA处理48 h,取上清离心后储存于-80 ℃。按照ELISA试剂盒说明书对上清PIGF进行检测,具体操作如下:根据待测样品量,截取相应酶标板孔数,每孔加入细胞培养上清100 μL及样品稀释液100 μL,室温孵育2 h,以400 μL洗涤液洗涤3次,每孔加入PIGF抗体工作液(PIGF conjugate) 200 μL,室温孵育1 h。再次以400 μL洗涤液洗涤3次,每孔加入200 μL新鲜配置的底物溶液,室温避光孵育30 min,加入反应终止液50 μL。摇匀后用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的吸光度值(D),计算培养上清中PIGF的浓度。

Western blot法取2×106个细胞弃去培养液,以预冷的PBS洗涤,加入相应体积的蛋白质裂解液,冰上放置30 min。然后以刮棒刮下细胞,收集到1.5 mL的离心管中。加入上述蛋白质裂解液后沸水浴10 min,然后于4 ℃下12 000×g离心10 min。取上清,用蛋白质定量试剂盒(K3001-BCA,上海申能博采生物有限公司)进行总蛋白质定量。根据测定的总蛋白质浓度,对照组及实验组分别取50 μg总蛋白质样品进行目标蛋白质及内参蛋白质GAPDH的表达检测,检测内参蛋白质的目的是确保每个样品孔上样的总蛋白质样品量一致,以进行目标蛋白质表达水平的比较。上述50 μg总蛋白质样品分别加入相应体积 β-巯基乙醇及1× SDS上样缓冲液,于100 ℃变性10 min,继而10 000×g离心5 min,取上清进行蛋白质SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂奶粉封闭1 h,加入一抗,4 ℃孵育过夜,PBS洗涤,加入相应二抗,室温放置1 h,用增强型化学超敏发光液(天根生化科技有限公司)在暗室中压片曝光,显影定影后胶片保存。

结　　　果

HCG以剂量依赖方式促进 Gcm-1基因表达为了分析不同剂量HCG对人滋养细胞Gcm-1表达的影响,在用不同浓度HCG处理人滋养细胞48 h后,以实时定量RT-PCR及Western blot分别鉴定在mRNA及蛋白质水平的Gcm-1基因表达。人滋养细胞经HCG处理48 h后,Gcm-1的mRNA水平随着HCG处理浓度增加而增高(图1A);Gcm-1蛋白质水平上调也呈现HCG剂量依赖关系,提示HCG能以剂量依赖的方式上调Gcm-1基因表达(图1B)。

A:mRNA level of Gcm-1;B:Protein level of Gcm-1.GAPDH is the loading control in Western blot.

图1不同浓度HCG对人滋养细胞Gcm-1基因表达的影响

Fig 1The influence of different HCG concentration on Gcm-1 gene expression in human trophoblast cells

HCG以剂量依赖方式促进PIGF分泌为了分析不同剂量HCG对人滋养细胞PIGF表达的影响,用不同浓度的HCG处理人滋养细胞48 h后,细胞培养上清被收集用于ELISA检测。PIGF水平随着HCG处理浓度的增加而提高,证实HCG以剂量依赖的方式促进人滋养细胞PIGF分泌(图2)。

Gcm-1 介导HCG促进滋养细胞PIGF分泌以上实验结果证明HCG可促进Gcm-1基因表达和PIGF分泌,已知Gcm-1是调控滋养细胞增殖及分化的重要转录因子,其可调控PIGF的表达[5]。为了验证HCG是否通过Gcm-1来介导PIGF分泌,本研究增加了用HCG、Gcm-1 siRNA同时(或)单独处理人滋养细胞的6组实验。结果发现,HCG及Gcm-1 siRNA同时处理组(图 3A,Lane 5)与HCG单独处理组(图3A,Lane 4)相比,Gcm-1 siRNA显著抑制HCG对于Gcm-1表达的促进作用(图3A)。采用HCG及Gcm-1 siRNA同时处理人滋养细胞后,HCG单独处理组(图3B,Lane 4)与HCG及Gcm-1 siRNA同时处理组(图3B,Lane 5)相比,PIGF分泌的抑制率约为45%(图3 B)。与HCG单独处理组相比,HCG及对照siRNA(NS siRNA)同时处理组并不影响HCG介导的Gcm-1的表达(图3A Lane 6)及PIGF的分泌(图3 B,Lane 6),提示HCG促进PIGF的分泌确实由Gcm-1介导。

图2不同浓度HCG对人滋养细胞PIGF分泌的影响

Fig 2The effect of different HCG concentration on PIGF secretion in human trophoblast cells

A:Gcm-1 siRNA inhibits HCG-induced PIGF secretion;B:Gcm-1 siRNA inhibits HCG-induced Gcm-1 gene expression.GAPDH is the loading control in Western blot.

图3Gcm-1介导HCG促进人滋养细胞PIGF分泌

Fig 3Gcm-1 mediates HCG-induced PIGF secretion in human trophoblast cells

讨　　　论

Gcm-1是主要在胎盘组织表达的转录因子,其主要调控下游靶基因合胞素(syncytin)、PIGF及高温需求蛋白A4(high-temperature requirement protein A4,HtrA4)表达,参与调控滋养细胞的增殖、融合(fusion)及分化[5,11-12]。妊高征孕妇胎盘Gcm-1基因表达显著下降、并表现出滋养细胞融合障碍及绒毛外滋养细胞分化异常,提示Gcm-1的表达下降与妊高征发生密切相关[5-6]。

PIGF作为Gcm-1的靶基因,主要参与滋养细胞对子宫血管系统重铸,妊高征孕妇与正常孕妇相比血清PIGF显著下降,且下降水平越低,妊高征症状愈重,提示PIGF水平下降是妊高征关键致病因素之一[5,7-8]。已有研究证实,妊高征患者PIGF降低的主要原因是可溶性血管内皮生长因子受体1(soluble fms-like tyrosine kinase 1,sFlt1)水平过度升高[13]。sFlt1虽然保持与配体PIGF结合的能力,但缺乏跨膜区和酪氨酸激酶活性。因此,过量sFlt1与游离的PIGF结合并拮抗PIGF促胎盘血管形成的能力,导致妊高征的发生[13]。根据孕妇血清sFlt1/PIGF比值可以有效预测短期内妊高征的发生及严重程度[8,14-15];而体外分离去除血清sFlt1可以有效恢复血清PIGF的水平,明显缓解妊高征的症状[9]。这些研究提示,恢复PIGF表达水平可能有助于妊高征的预防与治疗。

HCG是临床常用的促排卵及促黄体功能制剂,孕期可以安全应用。前期研究发现,HCG以正反馈的方式促进Gcm-1的表达[10],而另一项研究发现Gcm-1活化后可促进人滋养细胞PIGF表达[5]。在此基础上,本文利用人滋养细胞系,研究发现HCG通过上调Gcm-1表达促进PIGF分泌,提示早孕期滋养细胞分泌的HCG可能通过促进PIGF表达参与妊娠早期胎盘血管重铸。鉴于PIGF水平恢复可以很大程度上缓解妊高征的症状,因此HCG可能对妊高征发生发挥保护作用,并有可能成为潜在的治疗手段。此外,妊高征目前并无有效的预防措施,某些妊高征高危孕妇在早孕期接受一定剂量的重组HCG以提高血清PIGF水平,这可能有助于缓解妊高征高危孕妇的症状,发挥一定的预防作用。HCG的这些可能的临床应用仍需要大量深入的研究工作验证。深入研究HCG对PIGF调控的分子机制,可能拓展HCG的临床应用,为妊高征探寻新的预防及治疗策略。

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E-mail:zhaohongbo01@sina.com

Human chorionic gonadotropin mediates the secretion of placental growth factor by promoting the expression of glial cell missing-1 gene in human trophoblast cells

ZHAO Hong-bo▲ △, LI Rui-xia▲, ZHANG Wei

(Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases-Obstetrics and Gynecology Hospital,Fudan University,Shanghai 200011,China)

ObjectiveTo study the regulation of human chorionic gonadotropin (HCG) on the expression of glial cell missing 1 (Gcm-1) gene and secretion of placental growth factor (PIGF) in human trophoblast cells.MethodsWe used realtime RT-PCR and Western blot assay to determine the mRNA and protein levels of Gcm-1,and used ELISA assay to detect PIGF secretion after human choriocarcinoma cells Bewo were treated with different doses of HCG.We applied small interfering RNA to knockdown Gcm-1 gene expression,and then observed the effect of Gcm-1 siRNA on HCG-inducing PIGF secretion.ResultsHCG promoted Gcm-1 gene expression and PIGF secretion in human trophoblast cells in a dose-dependent manner,and HCG-inducing PIGF secretion was mediated by Gcm-1.ConclusionsHCG promotes PIGF secretion by increasing the expression of Gcm-1 gene in human trophoblast cells,indicating that HCG may be a protective factor for preeclampsia.

human chorionic gonadotropin;trophoblast cells;glial cell missing 1;placental growth factor

R714.2

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.05.003

2016-03-14;编辑:张秀峰)

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81571457) and Pujiang Talent Program of Shanghai,China (15PJ1400900).

国家自然科学基金(81571457);上海市浦江人才计划(15PJ1400900)

▲ZHAO Hong-bo and LI Rui-xia contributed equally to the article.