酢浆草药材薄层鉴别方法研究

敖娇+刘建军+鲍家科

【摘 要】 目的：建立酢浆草药材的薄层鉴别方法。方法：以酢浆草对照药材、β-谷甾醇为对照品，对影响薄层色谱的各个因素进行考察，筛选出最佳的薄层色谱条件。结果：筛选出酢浆草薄层鉴别的最佳条件，确定了实验方法。结论：建立了酢浆草药材的薄层鉴别方法，具有斑点清晰、分离度良好、操作简便、方法重复性好的特点，为进一步完善酢浆草的质量标准提供一定依据。

【关键词】 酢浆草；薄层鉴别；方法

【中图分类号】R282.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）12-0037-07

Abstract：Objective To establish a TLC identification method for Oxalis corniculata L.Methods Using both the standard Oxalis corniculata L.and β-sitosterol as the reference substances of TLC idetification， to investigate the factors affecting the thin layer chromatography， select the best thin layer chromatographic conditions. Results Selected the best thin layer chromatographic conditions of Oxlis corniculata L.，experiment method was confirmed. Conclusion Established the thin layer identification method of Oxalis corniculata L.Its characteristics inluded the clear spots， good separating degree， easy operation and the method repeatability well. The method could provide a certain basis for further improving the quality standards of Oxalis corniculata L.

Keywords：Oxalis corniculata L.； TLC identification ； Method

酢浆草为酢浆草科植物酢浆草Oxalis corniculata L.的全草，也称酸浆草、酸草、三叶酸、酸咪咪等， 为贵州等地民间及少数民族习用药材。酢浆草性味功效为酸、凉，具有清热解毒、利湿消肿、清肺化痰的功效，临床用于治疗神经衰弱、失眠、肺炎、扁桃体炎、急性肝炎、小儿上呼吸道感染等多种疾病[1]。酢浆草的化学成分主要有总黄酮类[2]、羟基肉桂酸、咖啡酸、槲皮素和没食子酸[3]，杨红原和李胜华对酢浆草进行分离纯化得到胡萝卜苷、β-谷甾醇等化合物[4-5]。目前，在云南、贵州、广西等省份的地方标准都收载有酢浆草药材，其鉴别项均以对照药材为对照进行薄层色谱鉴别。为进一步优化该检测项目，实验以β-谷甾醇、酢浆草对照药材为对照，对展开剂进行了调整，在此基础上建立了酢浆草药材的薄层鉴别，该方法具有斑点清晰、分离度良好、操作简便、方法重复性好的特点，为进一步完善酢浆草的质量标准提供一定依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 METTLER TOLEDO XS205分析天平；KQ-300DE型数控超声波清洗器；DK-98-IIA水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试药与试剂 β-谷甾醇对照品（批号： 110851-200202、酢浆草对照药材（批号：1299-0301）均购自中国药品生物制品检定所；硅胶G预制板（批号：20150406）、硅胶G（批号：0140121）、硅胶GF254预制板（批号：20140703）、硅胶H预制板（批号：20140806）均为青岛海洋化工厂分厂产品；所用试剂均为分析纯。

1.3 样品来源 实验收集到来自贵州、云南不同产地的13批酢浆草药材，来源见表1。由贵州省食品药品检验所李杨老师鉴定为酢浆草（Oxalis corniculata L.）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 取β-谷甾醇对照品适量，精密称定，甲醇溶解，制成浓度为0.312mg/ml的溶液。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 提取溶剂的考察 取酢浆草药材4份，各1g，精密称定，分别加入石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇10ml，超声提取30min，滤过，滤液作为供试品溶液。按照薄层色谱法（2015版《中国药典》附录VI B）实验，分别吸取对照品溶液1μl，供试品溶液2μl，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶8∶1.2∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置于日光下及365nm紫外光下检视，薄层色谱图见图1。结果表明，石油醚提取液斑点不及其它溶剂提取液的斑点多，乙酸乙酯、甲醇、乙醇提取液的斑点个数及大小一样，考虑毒性及价格，选择乙醇作为提取溶剂。

2.2.2 提取方法的考察 取酢浆草药材2份，各1g，精密称定，加入乙醇10ml，分别超声提取30min和回流提取30min，滤过，滤液作为供试品溶液。分别吸取对照品溶液1μl，供试品溶液2μl，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶8∶1.2∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下及紫外灯下检视，薄层色谱图见图2。结果表明，超声提取与回流提取基本无差别，选取超声方法为提取方法。

2.3 对照药材溶液的制备 取酢浆草对照药材1g，精密称定，按照供试品溶液的方法制备即得。

2.4 酢浆草药材薄层色谱方法学考察

2.4.1 显色剂的考察 取“2.2项”下的4个供试品溶液，照薄层色谱法试验，分别吸取对照品溶液1μl，对照药材溶液2μl，供试品溶液2μl，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶8∶1.2∶0.1）为展开剂，四张薄层板同时展开，取出，晾干，分别喷以10%硫酸乙醇溶液、5%香草醛硫酸溶液、10%磷钼酸溶液以及碘蒸气熏，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下及365nm紫外光下检视。结果表明： 在日光下检视，10%硫酸乙醇溶液和5%香草醛硫酸溶液显色后斑点较清晰，颜色鲜明，显色的斑点个数一致；磷钼酸溶液显色后斑点虽然清晰，但是不能反映出其他有的斑点的颜色，斑点个数较少；碘蒸汽熏的方法能使斑点显色，但斑点个数较少，所需时间较长，不及其他显色剂方便。在365nm紫外光下观察，10%硫酸乙醇溶液显色后的斑点更明显，在与对照品相对应的位置处显蓝色荧光；5%香草醛硫酸溶液及其他显色剂显色后均不显荧光斑点。为更好体现样品与对照药材中的斑点信息，选取10%硫酸乙醇溶液作为显色剂。

2.4.2 展开系统的考察 取“2.2项”下的4个供试品溶液，照薄层色谱法试验，分别吸取对照品溶液1μl，对照药材溶液2μl，供试品溶液2μl，点于硅胶G薄层板上，所考察的展开系统及结果见表2。经过对比及重复试验可知环己烷-三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶8∶1.2∶0.1）的展开系统稳定，展开的斑点较多，斑点间距离合适，分离度好，重现性好。因此选环己烷-三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶8∶1.2∶0.1）作为实验的展开系统。

2.4.3 点样量的考察 依次精密吸取供试品溶液1、2、3、4 μl；β-谷甾醇对照品溶液 1、2、3、4μl。点于同一薄层板上进行考察。结果表明，供试品溶液随着点样量的增加，斑点越加明显，但也出现拖尾现象，2μl的点样量合适；β-谷甾醇对照品溶液1μl即很清晰及圆整。因此最佳点样量确定为供试品溶液为2μl；β-谷甾醇对照品溶液为1μl。

2.4.4 展开距离考察 考察7、8、10、13cm的不同展开距离。结果表明，展开距离为7cm与8cm的斑点距离及个数相当，斑点分离好。展开距离为10cm的斑点距离拉大，但斑点个数与7cm、8cm一样。展开距离为13cm靠近溶剂前沿的斑点不圆整，扁平状，且出现边缘效应。因此实验选用7cm作为展开距离。

2.4.5 薄层板饱和时间考察 考察0、8、15、30min的不同饱和时间。结果表明，饱和时间越长，斑点移动距离越长，15min时，溶剂前沿附近斑点出现重叠，30min时，溶剂前沿附近斑点重叠严重。0min和8min时，斑点分离好，但0min时，有时会出现边缘效应，因此，实验选择8min作为薄层板的饱和时间。

2.5 方法耐用性考察

2.5.1 不同薄层板的考察 实验考察硅胶H预制板板、硅胶GF254预制板板、硅胶G预制板、硅胶G（批号：0140121）自制板4种类型的薄层板，薄层色谱图见3。结果表明：斑点在4种类型的薄层板上均能分离，硅胶H板接近溶剂前沿的斑点较硅胶G板上的斑点扁平，有斑点有少量重叠。硅胶GF254板上的斑点日光下检视与硅胶G板相当，在365nm紫外光下斑点显荧光，但不及硅胶G板清晰；在254nm紫外光下斑点显黑色，不清晰。硅胶G自制板斑点与相邻斑点分离度好，其它斑点移动距离不及硅胶G预制板上斑点移动距离远，但不影响斑点分离效果。硅胶G预制板与自制板均可作为本实验用薄层板。

2.5.2 温度的考察 分别在低温（4℃）、室温（22℃）、高温（40℃）进行温度的考察。结果表明：供试品和对照品在不同温度下的色谱行为一致，各斑点能较好的分离，说明温度对本实验方法影响不大，薄层色谱图见4。

2.5.3 湿度的考察 分别在高湿 （72%）、中湿 （47%）和低湿 （18%） 条件下进行考察，湿度以不同浓度的硫酸溶液进行控制。将点样后的薄层板放入展开缸，另一侧的展开槽里放一定浓度的硫酸，密闭10min后再加展开剂展开。当硫酸-水（27.5∶100， V/V）时，相对湿度为72%；当硫酸-水 （50∶100，V/V）时，相对湿度为47%；当硫酸-水（100∶95.5， V/V）时，相对湿度为18%。结果表明供试品和对照品在高湿、中湿和低湿环境各斑点均能实现较好的分离，说明本方法具有良好的环境适应性，薄层色谱图见5。

2.5.4 色谱条件的确定 取对照品溶液1μl，对照药材溶液2μl，供试品溶液2μl，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶8∶1.2∶0.1）为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下及365nm紫外光下检视。

2.6 酢浆草药材的薄层色谱图 将收集到的13批酢浆草药材，按“2.2项”下制备供试品溶液后，按“2.5.4”确定的色谱条件进行检测，薄层色谱图见6。结果表明，本试验建立的方法分离度高，重现性好，操作简单，可用于标准不完善的酢浆草药材的质量控制。

3 讨论

在展开剂考察过程中，曾试用二氯甲烷代替三氯甲烷，但二氯甲烷的沸点低，在常温下挥发性较三氯甲烷大，气压不稳定，展开的斑点位置不稳定，且斑点不及三氯甲烷的展开体系展开的斑点清晰，因此选用三氯甲烷为展开溶剂。

在预实验中，发现酢浆草对照药材溶液与样品溶液点样斑点大小一致，因此点样量的考察选用了样品溶液。

有关酢浆草的文献有用到异荭草素[7]、芦丁[2]为对照品进行总黄酮类含量测定，用刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷为对照品进行薄层鉴别，刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷为实验室自制[8]。β-谷甾醇是一种植物甾醇，药理研究表明：β-谷甾醇具有降低血清胆固醇、抗炎退热、抑制肿瘤，抑制乳腺增生等作用[9]。在抗癌机制的探讨中，β-谷甾醇对人肝癌 HepG2 细胞生长具有较强的抑制作用，对正常肝细胞 QSG7701 的生长及凋亡相关蛋白几乎没有影响，其通过线粒体途径及膜死亡受体途径诱导该细胞凋亡[10]。考虑到β-谷甾醇可能是酢浆草的功效成分之一，实验采用β-谷甾醇作为酢浆草薄层检测的对照，对照品易于获得，检测成本较为低廉。选用环己烷-三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶8∶1.2∶0.1）为展开剂，选用10%硫酸乙醇作为显色剂，样品中在与对照品及对照药材的位置处都显相同颜色的斑点，斑点颜色清晰，且分离度高、重现性好，为完善酢浆草的质量标准可提供实验依据。

参考文献

[1] 江毅，李朝斗，杨卫平，等.草药彩色图集[M].贵阳：贵州科技出版社，2001： 324.

[2] 谭萍，赵云婵.黔产酢浆草总黄酮含量的测定及提取方法研究[J].山西医药杂志，2006，35（5）：462.

[3] 吴高兵，陈华，姚志云.苗药酢浆草的化学成分研究[J].中国民族医药杂志，2014（01）25-26.

[4] 杨红原，赵桂兰，王军宪.红花酢浆草化学成分的研究[J].西北药学杂志，2006，21（4）：156-158.

[5] 李胜华.黄花酢浆草的化学成分研究[J].中国药学杂志，2013，48（ 21） ：1820-1822.

[6] 广西壮族自治区食品药品管理局.广西壮族自治区壮药质量标准（第二卷）[M].南宁：广西科学出版社，2011：282-283.

[7] 赵跃刚，王隶书，范艳君，等.酢浆草药材中总黄酮的含量测定[J].时珍国医国药，2011，22（1）：81-82.

[8] 廖惠平，陈思思，黄文平，等.酢浆草的薄层鉴别研究[J].江西中医药大学学报，2014， 26（4）：62-67.

[9] 魏金婷，刘文奇.植物药活性成分β-谷甾醇研究概况[J].菁田学院学报，2007，14（2）：38-40.

[10] 张忠泉，邢煜君，胡国强，等.β-谷甾醇诱导人肝癌HepG2 细胞凋亡机制研究[J].中国中药杂志，2011，36（15）：2145-2148.

（收稿日期：2016.04.29）