糖尿病肾病患者血清miRNA377的表达及其对SMAD信号通路调控作用

季振中，胡正国△，徐焱成

(武汉大学中南医院：1.综合医疗科；2.内分泌科 ，武汉 430071)



糖尿病肾病患者血清miRNA377的表达及其对SMAD信号通路调控作用

季振中1，胡正国1△，徐焱成2

(武汉大学中南医院：1.综合医疗科；2.内分泌科 ，武汉 430071)

目的探索糖尿病肾病(DN)患者血清miRNA377(miR377)的表达特点及其可能的下游调控通道。方法 用实时荧光定量PCR方法检测经肾活检确诊的DN组、糖尿病无肾病损害(DM)组和健康人群(对照组)血清中miR377的相对表达量，用TargetScan等生物信息学的方法预测miR377调节的靶基因，并在体外细胞模型中上调miR377的表达，检测下游机制蛋白。结果DN组(1.32±0.13)和DM组(0.92±0.11)患者血清中miR-377均高于对照组(0.33±0.06)，差异有统计学意义(P<0.01)；生物信息学分析显示为糖尿病肾病中miR377的靶基因为SMAD；Western blot 结果显示，转染miR377 mimics组HMC细胞中SMAD2和SMAD3蛋白的表达量均高于miR377 NC组和对照组(P<0.05)，而SMAD7在各组中表达量无明显差异(P>0.05)。结论糖尿病肾病患者血清的miR377存在异常高表达，可能预示肾脏病变的程度。

糖尿病肾病；微RNAs;计算生物学；miR377；SMAD；预后

糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者重要的微血管并发症，病理上为细胞膜外基质在肾小球系膜及基底膜内过度的积聚，最终引起肾小球纤维化。无论在欧美等发达国家，还是在中国，因DN而最终导致终末肾病(end stage renal disease，ESRD)的比例也逐年上升，DN的早诊断和早治疗可延缓疾病进展[1]。近年来，大量研究表明miRNA与多种疾病的发生、发展有关，有望成为疾病早期诊断标志物和潜在的治疗靶点。多项研究也证实，miRNA对DN多条信号通路的调控作用，在miRNA的调控下，系膜细胞肥大，细胞外基质逐渐沉积和足细胞凋亡，共同参与了小球硬化的过程[2]。此外，miRNA在不同细胞中的作用具有复杂性及细胞特异性，有关miRNA与DN的分子作用机制有待深入探索。miRNA在基因中的调控作用可能成为DN一个新的诊断标志及治疗靶点，将为DN的早期诊断和合理治疗带来新的思路[3]。Wang等[4]通过采用1型糖尿病小鼠及高糖状态下的人系膜细胞，发现miRNA377(miR377)在该细胞中高表达并与DN的病情进展有关，其机制是通过下调锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)及p21活化激酶(PAK1)，从而增加纤连蛋白(FN)的表达，而FN是肾小球细胞外基质(ECM)沉淀的主要蛋白之一。本研究通过实时荧光定量PCR(quantitative realtime polymerasechain reaction，qRT-PCR)检测DN患者和健康对照组血清中miR377的表达差异，分析其作为预测DN病情变化标志物的可能性，并探讨其在DN中的可能作用机制。

1　资料与方法

1.1一般资料DN组选择本院2012年1月至2014年6月临床诊断病经肾脏活检确诊的25例2型糖尿病(T2DM)患者，排除其他继发性肾小球、肾小管病变等；糖尿病无肾损害(DM)组共27例；健康体检者22例为健康对照组。DN组和DM组患者均患2型糖尿病，接受降糖治疗方案，血糖控制满意。本研究经本单位医学伦理委员会批准，且所有受试者均签署针对研究的知情同意书。所有均受试者抽取10 mL全血，1 200 r/min离心血清，保存于-80 ℃冰箱待下一步检测。

1.2主要试剂和仪器PCR引物、miR377-mimics和miR377-NC由广东锐博生物技术服务公司合成，Trizol试剂由美国Invitrogen公司提供，TaqMan MicroRNA反转录试剂盒、miR377和U6 TaqMan检测试剂盒(美国Applied Biosystems)。Liofectamine2000(美国lnvitrogen)氯仿、异丙醇、无水乙醇等其他常规化学试剂均为分析纯产品。Tpersonal PCR仪为德国Biometra公司产品。人肾系膜细胞系(HMC)由武汉大学中南医院科研中心保存，胎牛血清购自杭州四季青公司，高糖DMEM培养基和F12培养基购自美国Gibco公司，重组人转化生长因子(TGF)β1购自美园R&D公司，Bradford蛋白浓度试剂盒购自碧云天公司。

1.3qRT-PCR检测按相关说明书操作。用TaqMan法进行miR377和U6的qRT-PCR检测。TaqMan 2×Universal PCR Master Mix Ⅱ10 μL，TaqMan MicroRNA Assays 1 μL，得到反转录产物4 μL，用无RNA酶水补至20 μL。在反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循环50次。PCR反应在Tpersonal PCR仪上进行。

1.4生物信息学预测miR377靶基因用TargetScan、PicTar、miRanda和miRDB 4个软件进行在线预测miR377靶基因。

1.5下游靶基因验证采用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液(100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)常规培养HMC细胞，采用脂质体Liofectamine2000瞬时转染miR377 mimics及miR377 NC,对照组转染采用脂质体Liofectamine2000，瞬时转染后24 h采用qRT-PCR检测各组的miR377表达量。

1.6Western Blot检测蛋白转染48 h后，吸走上层培养基， 1×PBS洗涤两次，采用Bradford蛋白浓度试剂盒测定总蛋白浓度，将定量后的蛋白样品点样于聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上样孔中，每孔20μg，分离蛋白，将蛋白电转到聚偏二氟乙烯膜上，采用5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下孵育指定的一抗过夜，杂交反应，TBS缓冲液漂洗3次，再孵二抗，TBS缓冲液漂洗3次，化学发光显影，胶片曝光，结果用UVP 扫描仪扫描。以β-actin蛋白为内参。

2　结　果

2.1一般资料情况DN组男15例，女10例，年龄(44.2±4.7)岁，病程大于7年，eGFR(70.3±9.4)mL/min，24 h尿蛋白量为(5.2±3.3)g；病理均为典型K-W硬化性结节病灶，免疫荧光检测免疫复合物阴性，DN病变肾组织见图1。DM组男14例，女13例，年龄(53.1±2.9)岁，确诊糖尿病病程小于或等于1年，eGFR(84.3±4.8)mL/min，尿蛋白定量阴性。健康对照组男8例，女14例，年龄(42.8±2.5)岁，均为体检中心年龄大于30岁的健康人群。

2.2各组血清miR377表达量qRT-PCR检测结果显示，DN组血清miR377表达量(1.32±0.13)显著高于DM组(0.92±0.11)和健康对照组(0.33±0.06)，差异有统计学意义(P<0.01)；且DM组血清miR-377表达量也高于健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3miR377下游靶基因分析及预测TargetScan预测miR377靶基因为32个，PicTar预测为332个、miRanda预测为936个，miRDB预测为252个和miRDB 4个，预测结果显示，miR377调节靶基因非常广泛，涉及细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化和信号转导等各个方面。与肾脏纤维化和DN相关的SMAD信号通路基因为其潜在靶基因。选择了SMAD2、SMAD3、SMAD7进行下一步验证。

A：正常的肾脏组织；B：DN的肾脏组织。

图1电镜下的肾脏组织(×7 000)

a：P<0.01,与DM组及健康对照组比较；b:P<0.05与健康对照组比较。

图2各组血清miR377表达量比较

2.4miR377可抑制SMAD2和SMAD3的表达Westernblot 结果显示，转染miR377 mimics组HMC细胞中SMAD2和SMAD3蛋白的表达量均高于miR377 NC组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而SMAD7在各组中表达量无明显差异(P>0.05),见图3。

Blank：空白对照组；NC：miR377阴性对照组；miR377：转染miR-377 mimics组。

图3各组HMC细胞SMAD2和SMAD3表达情况

3　讨　论

MicoRNAs(miRNAs)是一类内源性的非编码单链RNA分子，长度在22 nt左右，广泛存在于植物、线虫和人类的细胞中。关于miRNA在各种疾病的发生、发展中作用的研究已成为当前生命科学领域的研究热点。miRNA通过对靶基因转录后的调控，使其在包括糖尿病在内的多种疾病中都发挥着重要作用[5]。然而，miRNAs在DN病理生理中的调控机制研究才刚刚起步[6]，人类已经得到实验证实的miRNAs有1 000多个，只少量的miRNAs分子的功能得到研究。miRNAs能调控肾脏的发生、发育，维持肾小球滤过屏障和集合管结构的完整性，一些特异性miRNAs能调控肾脏疾病的病理生理过程[7]，例如，miR15a与多囊肾病的发生密切相关[8]；细胞模拟实验研究显示，miR200和miR205能促进肾小管上皮细胞向间叶性细胞转化[9]，miR192和miR377可上调细胞肾小球系膜外基质蛋白的表达，加速肾小球硬化的发展[10-11]。Yang等[12]研究显示，尿液中miR377高表达可能作为糖尿病早期诊断的一个指标。因此，miR377参与了糖尿病肾病的发生、发展过程，miRNA在血液中比较稳定，其血液检测值能很好地反映患者体内miRNA水平，为探明其机制，本研究检测DN患者和健康对照组血清中miR377的表达差异，采用生物信息学方法预测其可能靶基因SMAD，并采用Western blot进行验证。

miRNA通过对靶基因的表达调控而发挥作用，作用靶点广泛，与糖尿病及糖尿病肾病关系密切的基因有胰岛素受体底物2基因(IRS2)、丝裂原活化蛋白激酶的激酶基因[5]。本研究结果显示，DN组血清miR377表达量明显高于健康人群，同时也高于DM组患者，提示血清miR377与DN的进展有一定关系。本研究生物信息学预测显示，miR377与肾脏纤维化和DN相关的SMAD信号通路基因为其潜在靶基因。为进一步研究，本研究采用人肾系膜细胞系，上调HMC细胞miR377水平后，发现SMAD2和SMAD3蛋白表达量增加。

转化生长因子 TGFβ/Smad 信号通路所属蛋白家族大，参与功能多，机制复杂，是被广为研究的一条信号通路，它与 DN 的发生、发展有着密切关系。通过 TGF-β/Smad 信号通路，Smad蛋白家族可诱导肾小球细胞增生和肥大，使细胞外基质增多，致肾小球硬化及肾间质纤维化，以此促使 DN 的不可逆进展[13]。Smad蛋白蛋白家族介导了 TGF-β 信号的转导，是唯一所知的 TGF-β 受体的胞内激酶底物[14]。多项研究报道TGF-β/Smad信号通路在糖尿病肾病的肾纤维化等过程。Sun等[15]报道紫杉醇通过调节miR192基因启动子序列，抑制miR192基因介导的TGF-β/Smad通路的激活，从而抑制慢性肾病的纤维化过程。有研究通过对高低糖培养的人肾小球系膜细胞进行芯片检测，发现高表达miR377可引起DN纤维粘连蛋白的增加从而对DN产生作用[4]。

本研究表明，DN患者血清的miR377存在异常高表达，可能预示肾脏病变的程度，提示其有潜在的DN血清标志物特异性，其下游机制可能是激活TGF-β/Smad通路，增加SMAD2和SMAD3蛋白表达量的表达。检测血液中DN特异性的miRNA并将其作为DN的生物学指标，这对于早期诊断和早期治疗DN可能具有重要的生物学意义[16]。为进一步研究miR377在糖尿病肾病中的功能，将通过体内动物实验，更好地研究其调控的分子机制。

[1]Wu H,Kong L,Zhou S,et al.The role of microRNAs in diabetic nephropathy[J].J Diabetes Res,2014:920134.

[2]Kato M,Natarajan R.MicroRNAs in diabetic nephropathy:functions,biomarkers,and therapeutic targets[J].Ann N Y Acad Sci,2015,1353(1):72-88.

[3]Bijkerk R,Duijs JM,Khairoun M,et al.Circulating microRNAs associate with diabetic nephropathy and systemic microvascular damage and normalize after simultaneous pancreas-kidney transplantation[J].Am J Transplant,2015,15(4):1081-1090.

[4]Wang Q,Wang YL,Minto AW,et al.MicroRNA-377 is up-regulated and can lead to increased fibronectin production in diabetic nephropathy[J].FASEB J,2008,22(12):4126-4135.

[5]Trionfini P,Benigni A,Remuzzi G.MicroRNAs in kidney physiology and disease[J].Nat Rev Nephrol,2015,11(1):23-33.

[6]Kantharidis P,Hagiwara S,Brennan E,et al.Study of microRNA in diabetic nephropathy:isolation,quantification and biological function[J].Nephrology (Carlton),2015,20(3):132-139.

[7]Koga K,Yokoi H,Mori K,et al.MicroRNA-26a inhibits TGF-β-induced extracellular matrix protein expression in podocytes by targeting CTGF and is downregulated in diabetic nephropathy[J].Diabetologia,2015,58(9):2169-2180.

[8]Zitman-Gal T,Green J,Pasmanik-Chor M,et al.Vitamin D manipulates miR-181c,miR-20b and miR-15a in human umbilical vein endothelial cells exposed to a diabetic-like environment[J].Cardiovasc Diabetol,2014,13:8.

[9]Reddy MA,Jin W,Villeneuve L,et al.Pro-inflammatory role of microrna-200 in vascular smooth muscle cells from diabetic mice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012,32(3):721-729.

[10]Krupa A,Jenkins R,Luo DD,et al.Loss of MicroRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy[J].J Am Soc Nephrol,2010,21(3):438-447.

[11]Kato M,Zhang J,Wang M,et al.MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruli and its function in TGF-beta-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(9):3432-3437.

[12]Yang Y,Xiao L,Li J,et al.Urine miRNAs:potential biomarkers for monitoring progression of early stages of diabetic nephropathy[J].Med Hypotheses,2013,81(2):274-278.

[13]Li JH,Huang XR,Zhu HJ,et al.Role of TGF-beta signaling in extracellular matrix production under high glucose conditions[J].Kidney Int,2003,63(6):2010-2019.

[14]Derynck R,Zhang YE.Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling[J].Nature,2003,425(6958):577-584.

[15]Sun L,Zhang D,Liu F,et al.Low-dose paclitaxel ameliorates fibrosis in the remnant kidney model by down-regulating miR-192[J].J Pathol,2011,225(3):364-377.

[16]Lee SY,Choi ME.Urinary biomarkers for early diabetic nephropathy:beyond albuminuria[J].Pediatr Nephrol,2015,30(7):1063-1075.

Mirna377 expression in serum of patients with diabetic nephropathy and the role of SMAD signaling pathway

Ji Zhenzhong1,Hu Zhengguo1△,Xu Yancheng2

(1.DepartmentofIntergratedWards;2.DepartmentofEndocrinology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430071,China)

ObjectiveTo explore the characteristics of patie nts with diabetic nephropathy serum miRNA377(miR377) expression and the possible regulation of downstream channels.MethodsReal-time PCR method to detect biopsy-confirmed DN group,diabetes without kidney damage group (DM) and serum of healthy people relative expression of miR377,with the TargetScan bioinformatics method for predicting the miR377 target gene regulation and raised miR377 expression in vitro model,the detection mechanism downstream protein.ResultsCompared with healthy control patients(0.33±0.06),patients with diabetic nephropathy(1.32±0.13) in serum miR377 expression (P<0.01),diabetes without kidney damage group(0.92±0.11) miR377 is also highly expressed (P<0.01),bioinformatics analysis showed that diabetic nephropathy the miR377 target genes of SMAD;Western blot showed transfected miR377 mimics group HMC cells SMAD2 and SMAD3 protein expression levels higher than miR377 NC group and the control group (P<0.05),while SMAD7 The expression in each group had no significant difference (P>0.05) amount.ConclusionThe patients with diabetic nephropathy serum miR377 expression exists abnormally high level,may indicate kidney disease,the mechanism may be activated TGF-β / Smad pathway and increased expression of SMAD2 SMAD3 protein expression.

diabetic nephropathies;microRNAs;computational biology;miRNA377;SMAD;prognosis

季振中(1984-)，主治医师，博士，主要从事糖尿病分子生物学研究。△

，E-mail:Huzg811@163.com。

·生物信息学·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.026

R587.1

A

1671-8348(2016)27-3824-03

2016-02-17

2016-04-06)