Th17细胞在不同国际预后指数组DLBCL中的表达及意义

许　昕　李庆山　朱志刚　杜庆华　钟伟杰　赵紫媛

广州市第一人民医院 (广州 510180)

Xu Xin, Li Qingshan, Zhu Zhigang, et al.

Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou 510180, China



Th17细胞在不同国际预后指数组DLBCL中的表达及意义

许昕李庆山朱志刚杜庆华钟伟杰赵紫媛

广州市第一人民医院 (广州 510180)

目的探讨初诊的弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者外周血Th17细胞的表达与国际预后指标(IPI)之间关系。方法初诊DLBCL组(n=45)按照国际预后指数(IPI)积分分为4组，采用ELISA和流式细胞术检测各个DLBCL组与正常对照组(n=43)的外周血中IL-17的浓度以及Th17阳性细胞比例，比较各组数值间的差异，并分析IPI的5个指标与IL-17的浓度以及Th17阳性细胞比例的相关性。结果DLBCL中高危组与高危组的IL-17的浓度以及Th17阳性细胞比例较正常对照组及其他IPI组降低，有显著性差异；DLBCL四组的IL-17的浓度以及Th17阳性细胞比例均低于正常对照组；且可见随着IPI分组的增高，IL-17的浓度以及Th17阳性细胞比例呈降低的趋势；IPI指标中年龄、临床分期、全身状态与Th17细胞的表达有相关性。结论初诊DLBCL患者外周血Th17细胞的表达与国际预后指标有关系；随着IPI积分的增加，DLBCL患者Th17细胞表达下降；临床上对于年龄60岁以上、临床分期Ⅲ期以上、长期卧床及需别人照顾的患者更要注意监测其外周血Th17细胞的表达情况。

弥漫大B细胞淋巴瘤Th17细胞国际预后指数

XuXin,LiQingshan,ZhuZhigang,etal.

GuangzhouFirstPeople’sHospital,Guangzhou510180,China

淋巴瘤可分为霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)两大类[1]，弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的侵袭性NHL，其发生发展与机体免疫功能状态密切相关，而T细胞执行肿瘤细胞免疫功能。Th17细胞是新发现的辅助性CD4+T细胞，已在多种肿瘤中证实Th17细胞会对抗肿瘤细胞免疫产生影响，但结论不一致。关于DLBCL患者Th17细胞的表达水平与预后的关系，目前未有报道。NHL国际预后指数评分即IPI积分，与NHL预后密切相关，包括年龄、临床分期、全身状态、结外器官侵犯情况、LDH值5个指标。本研究将DLBCL患者按照IPI积分进行分组，进行外周血IL-17及Th17细胞表达水平的对比，并进行IPI 指标与IL-17及Th17细胞表达间的相关性分析，研究Th17细胞的表达与DLBCL患者预后的关系。

1　资料与方法

1.1对象与分组45例DLBCL来源于2011年1月—2015年6月在我院老年病科血液肿瘤科住院并经病理活检明确诊断的患者，除DLBCL外无其他实体或血液系统肿瘤，无免疫及内分泌相关疾病，无严重或急性感染，肝肾功正常，非移植或手术患者。其中男28例、女17例，平均年龄(67±8.28)岁，按照NHL国际预后指标(IPI)危险分组参照标准[2]分为组1(IPI低危组)7例，组2(IPI低中危组)16例，组3(IPI中高危组)12例，组4(IPI高危组)10例。正常对照组选择我院老年病科体检中心健康体检者，除外肿瘤、血液系统疾病、免疫系统疾病、移植、糖尿病、外周血三系异常、肝肾功能异常、重症感染、感染急性期、手术等病史，共43例，其中男27例、女16例，平均年龄(65±7.82)岁。DLBCL组及正常对照组年龄、性别上相匹配。

1.2方法

1.2.1ELISA法检测血清IL-17浓度①标本采集：初诊DLBCL组每例患者在治疗前无菌抽取外周静脉血5 mL，静置、离心后取血清分装并置于-80 ℃冰箱保存备检；抽取健康体检者外周静脉血5 mL，同前处理。②ELISA法测定外周血IL-17浓度：严格按照ELISA厂家产品试剂盒所附说明书进行操作。

1.2.2流式细胞术检测外周血Th17细胞的比例①标本采集：初诊DLBCL组治疗前采集外周静脉血各5 ml， Ficoll-Hypaque梯度离心法分离出单个核细胞(MNC)；抽取健康体检者外周静脉血5 mL，同前处理。②流式细胞术检测外周血Th17细胞比例：RPMI 1640培养液重悬MNC，调节细胞浓度为2×106/mL，加入PMA和Ionomycin于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养1h，加入莫能霉素继续培养5 h，固定、破膜、孵育、离心，加入抗人IL-17 Alexa Fluor 647/CD3 FITC/CD4 PE抗体，对照组则加入抗人IL-17同型对照鼠 IgG1/CD3 FITC/CD4 PE，混匀后室温暗处孵育30分钟，洗涤并重悬细胞，半小时内上机检测。

2　结　果

2.1不同IPI分组的DLBCL患者外周血IL-17浓度及Th17细胞阳性细胞的比较DLBCL中高危组与高危组的IL-17的浓度以及Th17阳性细胞比例较正常对照组及其他IPI组降低，有显著性差异(P<0.05)；DLBCL四组的IL-17的浓度以及Th17阳性细胞比例均低于正常对照组；且可见随着IPI分组的增高，IL-17的浓度以及Th17阳性细胞比例呈降低的趋势。(见表1、图1、图2)

表1　不同IPI分组DLBCL患者与正常人外周血IL-17浓度(pg/mL)及Th17细胞比例(%)比较

注：①与正常对照组比较,*P<0.05; 与DLBCL低危组比较,#P<0.05; 与DLBCL低中危组比较，▲P<0.05; 与DLBCL中高危组比较，★P<0.05。②IL-17浓度的比较：DLBCL低危组、低中危组、中高危组、高危组与正常对照组比较，分别为(t=1.392,P=0.168)、(t=1.457,P=0.150)、(t=3.427,P=0.023)、(t=4.910,P=0.001)；而DLBCL低危组、低中危组、中高危组、高危组4组间比较(F=2.358,P=0.043)，其中中高危组与低危组、低中危组比较分别为P=0.024、P=0.012，高危组与低危组、低中危组、中高危组比较分别为P=0.003、P=0.008、P=0.028。③Th17细胞比例的比较：DLBCL低危组、低中危组、中高危组、高危组与正常对照组比较，分别为(t=1.614,P=0.181)、(t=2.018,P=0.117)、(t=3.881,P=0.027)、(t=5.340，P=0.007)；而DLBCL低危组、低中危组、中高危组、高危组4组间比较(F=2.833,P=0.044)。

2.2IPI 5个指标与DLBCL患者外周血IL-17浓度及Th17细胞比例之间的相关性分析对45例DLBCL患者的5个IPI预后指标与外周血IL-17浓度及Th17细胞比例之间的相关性进行分析，年龄、临床分期、全身状态与外周血IL-17浓度及Th17细胞比例之间有相关性(见表2)，结外器官侵犯情况、LDH值与外周血IL-17浓度及Th17细胞比例之间无相关性。

表2IPI指标与T淋巴细胞亚群有相关性的结果

IPI指标相关系数(r)IL-17Th17P值IL-17Th17年龄-0.604-0.7430.0290.004临床分期-0.663-0.6210.0130.023全身状态-0.606-0.6070.0280.028

图1　正常对照组与不同IPI分组IL17浓度直方图

图2　正常对照组与不同IPI分组Th17百分比直方图

3　讨　论

DLBCL是最常见的侵袭性NHL，其发生、发展通常伴有细胞免疫功能的紊乱。机体的抗肿瘤免疫以T淋巴细胞介导的细胞免疫为主。T细胞按CD表型分为CD4+和CD8+两大亚群，按功能可分为辅助性、细胞毒性T细胞等[3]。一般认为，CD4+T淋巴细胞减少会导致免疫功能低下，而CD8+T淋巴细胞则在免疫反应中起负向作用，有利于肿瘤增长。因此，临床上检测T淋巴细胞亚群可反映细胞免疫状态，有助于肿瘤预后判断。Th17细胞是近年来新发现的一类辅助性CD4+T细胞，其标志性细胞因子IL-17具有放大炎症反应、促进细胞增殖等作用[4-5]。既往部分研究提示Th17细胞可促进肿瘤生长。Numasaki等发现IL-17可促进非小细胞肺癌的生长[6]；Miyahara Y等发现进行IL-17cDNA转染可以促进裸鼠子宫颈癌的形成[7]。Kato等发现IL-17 mRNA表达阳性的卵巢癌组织中微血管密度较阴性者显著升高[8]。上述研究结果提示，Th17细胞可能通过促进血管生成从而利于肿瘤生长。但同时也有研究结论相反。Muranski等在小鼠黑色素瘤模型中，发现Th17细胞可发挥依赖于IFN-γ的抗肿瘤免疫效应[9]。Kryczek等发现Th17细胞可刺激CXCL9和CXCL10的表达起到抗肿瘤作用[10]。Cantini等则发现输注正常小鼠脾脏Th17细胞的荷瘤鼠生存期明显延长[11]。以上研究提示Th17细胞可能在不同的肿瘤中发挥不同的效应。在DLBCL中Th17细胞作用如何，其表达水平与DLBCL的预后之间关系如何，目前还缺乏相关研究。

DLBCL患者的IPI积分决定其预后，IPI积分与DLBCL患者的细胞免疫状态关系如何，国内外也缺乏相应研究。本研究分析了不同IPI分组DLBCL患者外周血IL-17浓度和Th17细胞阳性细胞比例，结果显示：DLBCL中高危组与高危组的IL-17的浓度以及Th17阳性细胞比例较正常对照组及其他IPI组显著降低；DLBCL四组的IL-17的浓度以及Th17阳性细胞比例均低于正常对照组；且随着IPI分组的增高，IL-17的浓度以及Th17阳性细胞比例呈降低的趋势。上述研究结果表明，Th17细胞表达水平越低，患者预后越差。提示我们临床上对DLBCL患者进行IPI评分时，可结合外周血IL-17浓度及Th17细胞比例进行考虑，可对预后做出更全面判断；同时也提示，Th17细胞可能在DLBCL中起到抗肿瘤效应，上调Th17细胞可能有助于治疗DLBCL，给DLBCL的细胞免疫治疗揭示了新的研究方向。

本研究还进行了IPI 指标与患者外周血Th17细胞表达之间相关性的分析。结果显示：DLBCL患者的年龄、临床分期、全身状态与患者外周血Th17细胞表达有相关性，而结外病变和LDH水平与患者外周血Th17细胞表达无相关性。提示我们在临床工作中对于年龄60岁以上、临床分期Ⅲ期以上、长期卧床及需别人照顾的患者更要注意监测其Th17细胞的表达情况。

综上所述，DLBCL患者Th17细胞表达水平与其预后有密切关系，临床上需注意检测DLBCL患者IL-17浓度及Th17细胞比例，有助于预后判断；Th17细胞可能在DLBCL中起到抗肿瘤效应，上调Th17细胞表达可能是DLBCL细胞免疫治疗新的研究方向。本课题组也将在Th17细胞调控DLBCL肿瘤生长这方面进行更多研究，为DLBCL细胞免疫治疗提供更多的实验依据。

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Expression of Th17 cells in different DLBCL IPI groups and its significance

ObjectiveTo explore the relationship between the international prognosis indexes(IPI) and the Th17 cells expression in DLBCL patients.MethodsDLBCL patients (n=45) were divided into 4 groups according to IPI score, peripheral blood were taken from each person in DLBCL groups and normal group. We used ELISA to test IL-17 and flow cytometry (FCM) to examine the Th17 positive cells. We compared the value of each group, and analyzed the relativity of IPI and Th17 cells’ expression.ResultsTh17 cells’ expression level in middle-high risk group and high risk group were higher than that in normal group and other IPI groups; Th17 cells’ expression level in DLBCL groups were all lower than that in normal group; Th17 cells decreased while IPI score increased; Age, clinical stage and general body state have the relativity with DLBCL patients’ Th17 cells expression level.ConclusionTh17 cells in DLBCL patients has the relativity with prognosis index. In our clinical diagnosis and treatment， we need to pay more attention to those patients who are over 60 years old, or whose clinical stage is above Ⅲ phase, or who need to stay on bed for a long time and need other peoples’ help .

DLBCL; Th17 cell; IPI

广东省科技计划项目(2013B021800040)

许昕，E-mail：404163425@qq.com

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.05.005

2016- 06- 07)