饲料中黄曲霉毒素检测方法研究进展

刘利晓 ，张 亮 ，向艳娥 ，黄志伟 ，李洪波 ，崔 佳

（1.河南省驻马店市兽药饲料（动物产品）质量检验监测中心，河南 驻马店 463000；2.杭州双康饲料有限公司，浙江 杭州 310000）

饲料中黄曲霉毒素检测方法研究进展

刘利晓1，张 亮1，向艳娥1，黄志伟1，李洪波1，崔 佳2

（1.河南省驻马店市兽药饲料（动物产品）质量检验监测中心，河南 驻马店 463000；2.杭州双康饲料有限公司，浙江 杭州 310000）

饲料在自然条件下污染的黄曲霉毒素主要包括B1、B2、G1、G24种，因为黄曲霉毒素B1具有致癌性，饲料和粮食中一般以黄曲霉毒素B1作为黄曲霉毒素含量评价的主要指标，我国饲料卫生标准GB 13078-2001只对黄曲霉毒素B1限量进行了规定。目前，对饲料黄曲霉毒素的检测方法有胶体金法、薄层分析法、酶联免疫法、高效液相色谱法，液相色谱—串联质谱法等。主要对近年来饲料中黄曲霉毒素检测方法研究进展进行了综述，讨论了各方法的优、缺点，以期为限量要求下的方法选择提供依据。

黄曲霉毒素；检测方法；研究进展

黄曲霉毒素是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的次生代谢产物，是世界卫生组织公认的致癌物，是一种天然存在的、毒性极强的剧毒物质，并具有致突变、致畸形和致癌作用。饲料在自然条件下污染的黄曲霉毒素主要包括 B1、B2、G1、G24 种， 因为黄曲霉毒素B1的具有致癌性，饲料和粮食中一般以黄曲霉毒素B1作为黄曲霉毒素含量评价的主要指标。我国饲料卫生标准GB 13078-2001只针对污染范围最广、危害最大的黄曲霉毒素B1限量进行了规定［1］。黄曲霉毒素的检测方法要满足相应的限量要求，该文对现有检测方法进行了综述，讨论了各方法的优、缺点，为限量要求下的方法选择提供依据。

1 饲料中黄曲霉毒素限量要求

我国饲料卫生标准规定的饲料、饲料添加剂中黄曲霉毒素B1的限量见表1。

2 现有黄曲霉毒素检测方法比较

目前，我国饲料中黄曲霉毒素的国家标准检测方法主要包括胶体金法、薄层分析法（TLC）、酶联免疫法（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱—串联质谱法（LC-MS/MS）。

表1 饲料、饲料添加剂中黄曲霉毒素B1的限量标准 μg/kg

2.1 胶体金法 该方法的原理是试样中黄曲霉毒素B1在层析过程中与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素膜检测线上黄曲霉毒素B1-BSA偶联物的免疫反应，使检测线变浅，通过检测线颜色变化进行测定［2］。我国国家标准中该方法黄曲霉毒素B1的检出限可以达到1 μg/kg，明显低于国家限量标准。王督等［3］采用胶体金免疫层析法快速定量分析粮油农产品中（花生、玉米、大米、小麦）黄曲霉毒素B1，4种样品检测的线性范围为1.0～20.0 μg/kg，方法定量限为 1.0 μg/kg，样品加标回收率为75%～106%，RSD＜20%。与免疫亲和柱净化-HPLC法相比，相对误差＜15%，样品检测时间只需15 min。徐振斌等［4］建立了胶体金免疫层析法快速定量检测玉米中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2总量的分析方法，最低检测限和最低定量限分别为1.0 μg/kg和 3.0 μg/kg，方法简便快速、灵敏度高、重现性好，可用于玉米中上述4种黄曲霉毒素总量的快速定量检测。

胶体金免疫层析技术的优点为简单、快速、成本低廉，适用于现场检测和大规模样品筛查。但其灵敏度低和不能定量的缺点，也使胶体金免疫层析技术在一些领域内的应用受到限制。目前研究胶体金免疫层析方法与其他仪器结合，建立黄曲霉毒素B1快速检测综合体系将会是未来的发展趋势。

2.2 薄层分析法 TLC法是传统的检测黄曲霉毒素B1最常用方法，也是我国测定饲料中黄曲霉毒素B1的国家标准方法之一［5］。该方法是经典的化学分析方法，优点是设备简单，操作方便，分析成本低，较适合对黄曲霉毒素B1的定性检测；其缺点是对检测的规范和熟练程度要求高，准确度较低，且重复性较差。

2.3 酶联免疫吸附法 利用ELISA检测黄曲霉毒素的原理是毒素抗原抗体直接的竞争性反应，也是我国测定饲料中黄曲霉毒素B1的国家标准方法之一［6］。 国家标准中该方法的检出限为 0.2 μg/kg。 相比于薄层分析法，ELISA法灵敏度高，操作简便，分析速度快，并且可以同时处理大批量样品，但由于同类分子的相似性，ELISA法容易对结构相似的其他黄曲霉毒素或化学物质产生一定的交叉反应，有可能带来假阳性、假阴性结果，检验精确度有待提高。李海礁等［7］通过对同一黄曲霉毒素阳性玉米粉样品分别采用HPLC和ELISA法进行不同实验室间对比，得出在保证检测结果一致的情况下，ELISA法同时具有检测成本低、设备场所要求低、操作简便、快速并且可以同时进行大量样本测定等优点。李敏等［8］为提高黄曲霉毒素B1酶联免疫分析灵敏度，建立了基于异源策略的间接竞争酶联免疫分析（IC-ELISA）方法，将该方法应用于实际花生中黄曲霉毒素的检测，同时，将结果与HPLC法结果进行比对，两者有很高的符合度，并且，在保证特异性检测黄曲霉毒素B1的条件下，比同源ELISA方法检测灵敏度提高了81.25%，为进一步建立农产品中黄曲霉毒素B1快速特异性检测方法奠定了重要基础。目前，通过优化一系列试剂盒参数，研制高灵敏度黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒的研究也在开展［9］。在实验检测活动中，ELISA法已经被很多企业和检测机构所采用，作为阳性样品的初筛工具。

2.4 高效液相色谱法 HPLC法也是目前饲料中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的检验国标方法［10］。 该方法原理为试样经过甲醇—水提取后，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析柱层析净化，经高效液相色谱仪分离、荧光检测器柱后光衍生测定黄曲霉毒素含量。该国标方法采用柱后衍生方法，相比常用的三氟乙酸衍生法、碘衍生法、光化学衍生器不需要其他化学试剂，只是连接到色谱柱和检测器之间，操作简单，重复性好，灵敏度高。黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的检出限分别为 0.2、0.2、0.3、0.3 μg/kg。冯秋月等［11］建立了HPLC-免疫亲和柱净化，柱后光化学衍生检测玉米中 4 种黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的分析方法，分析时间在6～11 min内完成，检测定量限分别为 0.10、0.03、0.10、0.03 μg/kg 。 完全符合并高于欧盟检测标准定量，通过光化学检测器在线衍生将黄曲霉毒素B1、G1的分析定量限提高到2.7倍和3.6倍。 玉米基质中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2在添加水平为 10、3、10、3 μg/L 时其回收率分别为 90.3%、85.65%、93.5%、92.8%，其线性范围分别为 0～20μg/L、0～6 μg/L、0～20 μg/L、0～6 μg/L，RSD 分别为 2.3%、1.5%、2.7%、3.2%。笔者所在检验室按照国标方法前处理样品 （包括配合饲料、浓缩饲料和玉米、麸皮、豆粕、棉籽粕、玉米酒精糟等饲料原料），实验结果表明：黄曲霉毒素浓度在0～50 ng/mL范围内呈良好的线性关系，相关系数R达到0.999 99以上。与液相色谱—串联质谱法相比，不同样品基质之间干扰不大，黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2回收率均能达到90%左右。

HPLC法的优点是测定准确、灵敏度高、净化效果好、回收率高，可同时测定多种黄曲霉毒素成分，完成定性、定量测定。但缺点是免疫亲和柱的价格昂贵，检测成本高，前处理复杂，检验速度较慢，且需要在专业实验室经专业人员进行检测，不能满足黄曲霉毒素现场筛查和质量控制的需求。

2.5 液相色谱—串联质谱法 我国农业行业标准NY/T 2071-2011规定了饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素含量的液相色谱—串联质谱测定方法。该方法原理为试样中的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素经乙腈溶液提取，正己烷脱脂及霉菌毒素多功能净化柱净化后，氮气吹干，甲酸乙腈溶液注解，采用色谱保留时间和质谱碎片及其离子丰度比定性，外标法定量［12］。相比于HPLC法，该方法无需进行柱前或柱后衍生处理，操作相对简捷，分析时间较短，且可以同时检测黄曲霉素毒素和其他各类真菌毒素，降低检测成本。

LC-MS/MS法具有比HPLC更高的灵敏度和准确性，但在我国测定饲料黄曲霉毒素的方法标准中，灵敏度却低于HPLC法。我国农业部行业标准中 LC-MS/MS 法黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的检出限均为1 μg/kg，高于国家标准HPLC法的检出限。而且LC-MS/MS法的基质抑制效应对检测结果定量准确性影响较大［13］。

笔者所在检验室按照NY/T 2071-2011标准方法前处理样品（包括配合饲料、浓缩饲料和玉米、麸皮、豆粕、棉籽粕、玉米酒精糟等饲料原料），质控点选用2倍定量限，标准工作液外标法单点校正，实验结果表明不同饲料样品之间基质干扰不同，不同饲料回收率差异较大。进一步优化前处理方法，降低基质效应、提高检测灵敏度是LC-MS/MS法测定饲料中黄曲霉毒素所面对的首要问题。王秀嫔等［14］建立了超声提取—液相色谱—电喷雾三重串联四极杆质谱测定玉米、大米、大豆等粮油固体样品中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的方法， 结果表明以黄曲霉毒素M1作为内标，可以有效地降低基质效应的影响，相比于外标法能极大地提高方法的准确度。该方法为今后黄曲霉毒素的液相色谱—质谱检测提供了新的思路。

3 结论

随着检测技术的不断发展，饲料黄曲霉毒素的检测方法越来越多，检测效率越来越高。由于各种单一方法的局限及不同方法的互补性，衍生出复合型的检测方法，不仅综合了不同方法的优点，提高了检测精度，而且通过互补使其灵敏度更高，特异性更强，前处理更加简单。在未来，一方面要推动黄曲霉毒素向集成、准确、快速、简便、智能化的快速检测技术发展；另一方面，要大力发展技术特异性强、灵敏度高、检测限低、定量结果准确、自动化程度高的先进仪器技术，二者的相互结合使用，将是以后的发展趋势。

［1］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB 13078-2001，饲料卫生标准［S］.北京：中国标准出版社，2001.

［2］中华人民共和国农业部.NY/T 2550-2014，饲料中黄曲霉毒素B1的测定胶体金法［S］.北京：中国农业出版社，2014.

［3］王督，张文，李培武，等.胶体金免疫层析法快速定量分析粮油农产品中黄曲霉毒素B1［J］.中国油料作物学报，2014，36（4）：529-532.

［4］徐振斌，胡东青，里南，等.胶体金免疫层析法快速定量检测玉米中黄曲霉毒素［J］.粮食科技与经济，2013，38（3）：24-26.

［5］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 8381-2008，饲料中黄曲霉毒素B1的测定 半定量薄层色谱法［S］.北京：中国标准出版社，2008.

［6］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 17480-2008，饲料中黄曲霉毒素B1的测定酶联免疫吸附法［S］.北京：中国标准出版社，2008.

［7］李海礁，喻东威，刘志楠，等.谷物中黄曲霉毒素B1检测方法的研究［J］.食品研究与开发，2013，34（21）：83-85.

［8］李敏，马飞，李培武，等.基于异源策略的黄曲霉毒素B1酶联免疫（ELISA）分析方法的建立［J］.中国油料作物学报，2014，36（6）：802-807.

［9］孙清，李谷丰，邓乾民，等.高灵敏度黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒的研制及应用 ［J］.环境化学，2015，34（10）：1845-1853.

［10］国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.GB/T 30955-2014， 饲料中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的测定 免疫亲和柱净化—高效液相色谱法［S］.北京：中国标准出版社，2014.

［11］冯秋月，刘滢，刘媛媛，等.光化学衍生检测玉米中4种黄曲霉毒素［J］.食品科学技术学报，2015，33（5）：69-73.

［12］中华人民共和国农业部.NY/T 2071-2011，饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的测定液相色谱—串联质谱法［S］.北京：中国标准出版社，2011.

［13］王少敏，许勇，毛丹，等.HPLC-MS/MS法测定中药桃仁中黄曲霉毒素 G2、G1、B2、B1［J］.药物分析杂志，2011，31（5）：907-911.

［14］王秀嫔，李培武，杨扬，等.液相色谱—三重串联四极杆质谱测定粮油中的黄曲霉毒素 ［J］.色谱，2011（6）：517-522.

S816.17

A文章顺序编号：1672-5190（2016）03-0033-03

2016－03－01

刘利晓（1982—），女，畜牧师，硕士，主要从事兽药、饲料与畜产品检测工作。

（责任编辑：钱英红）