奶牛子宫内膜组织体外培养方法的建立及前列腺素E2和F2α受体分布的研究

张双翼 ，毛 伟 ，刘 博 ，曹金山

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018）

奶牛子宫内膜组织体外培养方法的建立及前列腺素E2和F2α受体分布的研究

张双翼1，2，毛 伟1，2，刘 博1，2，曹金山1，2

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018）

［目的］建立体外培养荷斯坦奶牛子宫内膜组织的方法及检测子宫内膜组织中前列腺素E2和前列腺素F2α受体的分布情况。［方法］挑选新鲜、健康的发情前期奶牛子宫内膜组织，采集双侧子宫角部位内膜组织，体外悬浮培养组织小块并通过组织学形态鉴定培养效果。通过RT-qPCR方法检测PGE2受体 EP1、EP2、EP3（EP3A、EP3B、EP3C、EP3D）、EP4 和 PGF2α受体 FP 的表达情况。 ［结果］HE 染色表明，体外培养的奶牛子宫内膜组织结构完整，细胞和腺体形态完好，细胞核完好；发情前期奶牛子宫角部位内膜组织中PGE2和PGF2α受体均有表达，且表达量存在差异，其中PGE2受体EP4相对表达量最高，而EP1、EP3B及PGF2α受体FP的相对表达量较低。［结论］成功地建立了奶牛子宫内膜组织的体外培养方法；PGE2和PGF2α的受体在奶牛子宫内膜组织中均有表达，但不同受体的表达量有所不同。

前列腺素；PGE2；PGF2α；受体；实时荧光定量 PCR

提高奶牛繁殖能力是保障和促进奶牛养殖业健康和快速发展的重要基础。目前，导致奶牛繁殖力下降的主要疾病为奶牛不孕症。研究表明，在临床上引起奶牛不孕的主要因素是生殖器官疾病和机能障碍。对内蒙地区奶牛不孕症的病因进行调查，发现子宫内膜炎性的不孕症占不孕症奶牛的2/3。奶牛子宫内膜炎的治疗方法主要有子宫冲洗法、子宫灌注抗生素法、全身抗生素疗法、激素疗法、生物疗法、中草药疗法等。但是这些治疗方法中均没有考虑到子宫内膜的保护与修复问题。此外，奶牛的分娩、流产或其他疾病过程也可能对子宫内膜造成损伤。子宫内膜与胎儿的孕育过程密切相关，其微环境的稳态与健全对胚胎的顺利生长非常重要。因此，在治疗子宫疾病及日常奶牛养殖过程中，应该考虑子宫内膜的保护与修复问题。大量研究表明，子宫内膜有很强的自我修复功能，那么，其中的修复机制能否为兽医临床提供一些潜在的治疗子宫内膜损伤的方法？但是目前，子宫内膜的自我修复机制尚未被阐明。

前列腺素类化合物（prostaglandin）是花生四烯酸在环氧合酶 （cyclooxygenase，COX）作用下的产物， 包括 prostaglandin E2（PGE2）、prostaglandin I2（PGI2）、prostaglandin F2α（PGF2α）、prostaglandin D2（PGD2），前列腺素类化合物通过与G蛋白偶联的受体结合后发挥作用。目前，已发现的PGE2受体有EP1、EP2、EP3 及其亚型 EP3A、EP3B、EP3C、EP3D，EP4，这些受体与不同的G蛋白偶联发挥作用。EP2、EP4与Gs偶联，导致第二信使cAMP升高，而EP1与哪一种G蛋白偶联还未被发现，但EP1被激活后可以导致Ca2+浓度升高。EP3A与Gi偶联，导致cAMP含量下降，EP3B、EP3C与Gs偶联，可以使胞内 cAMP含量升高，EP3D 与 Gi、Gs、Gq偶联，在不同情况下升高或下调cAMP，也可以促进磷脂酰肌醇分解为三磷酸腺苷和二酰基甘油，继而发挥其生物学效应。PGF2α受体（FP）与Gq结合，促进磷脂酰肌醇分解为三磷酸腺苷和二酰基甘油，进而发挥作用。研究表明，COX-1和COX-2存在于子宫内膜中［1］。COX-2的分泌量随着生理周期的变化呈现周期性变化。在增殖期的子宫内膜上皮细胞中COX-2表达量升高，在子宫内膜癌细胞中COX-2表达量也升高［2］。COX-2的抑制剂能够抑制子宫内膜移位组织的生长和移位组织中血管的发生［3］。研究证实，PGE2和PGF2α的受体在增殖期的子宫内膜上皮细胞中表达量明显上升［4］。研究表明，PGF2α在子宫内膜的重建过程中发挥重要作用［5］。在mPGES（PGE2合成酶）基因敲除鼠上开展的研究证实，PGE2能够影响子宫内膜组织的生长［6］。在子宫内膜上皮细胞中，PGE2和PGF2α能够诱导结缔组织生长因子（CTGF）mRNA 和蛋白的表达［7］。在人的子宫内膜上皮细胞中，PGF2α能够诱导血管内皮生长因子（VEGF）的表达［8］。EP2/EP4 的特异性抑制剂能够抑制子宫内膜异位组织部位的生长以及血管和神经的生长［9-10］。以上提示，PGE2和 PGF2α在子宫内膜的自我修复过程中可能发挥作用。

为了研究PGE2和PGF2α在奶牛子宫内膜自我修复过程中是否发挥作用，首先应明确PGE2和PGF2α受体在奶牛子宫内膜中的表达情况。该研究旨在通过建立体外培养奶牛子宫内膜组织的方法并检测PGE2和PGF2α受体在子宫内膜中的分布情况，为前列腺素类药物在奶牛产后子宫内膜损伤治疗中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 组织：采集内蒙古呼和浩特市某屠宰场当天宰杀的健康荷斯坦奶牛双侧子宫角，通过肉眼观察卵泡大小及黄体形态，选取发情前期的子宫角部位组织。

1.1.2 主要试剂：胎牛血清 （ExCell Biology，Inc.，China），DMEM/F-12（Gibco，USA），青链霉素（Gibco，USA），两性霉素 B（GENERAY，China），AxyPrep Multisource Total mRNA Miniprep Kit（Axygen Scientific，USA），SYBR PremixExTaq Ⅱ （TaKaRa，Japan），PrimerScriptRT MasterMix （TaKaRa，Japan），6×Loading Buffer （TaKaRa，Japan）， 琼脂糖（Invitrogen，China）。 引物由 Invitrogen 公司合成。

1.1.3 仪器设备：高压自动蒸汽灭菌锅，购自Hirayama公司；低速台式离心机，购自上海安亭公司；高速低温离心机，购自Beckman公司；超纯水仪，购自Biotech公司；制冰机，购自Panasonic公司；-80℃低温冰箱，购自Thermo公司；-20℃低温冰箱，购自美菱公司；酶标仪，购自Bio-Tek公司；ABIViiATM7型实时荧光定量PCR仪，购自Life公司；光学显微镜，购自OLYMPUS公司；Champ GelTM 5000型凝胶成像系统，购自Vilber公司。

1.2 试验方法

1.2.1 组织样品采集及处理：在屠宰场，以无菌操作取新鲜的奶牛子宫角，长度4 cm左右，用冰盒保存，尽快送到实验室。在实验室内，将新鲜组织用PBS （含 100 IU/mL 双抗，2.5 μg/mL 两性霉素 B）冲洗3遍，4℃保存1 h，然后在无菌条件下纵向剖开子宫角，用弯剪刀和眼科镊将含有子宫内膜上皮细胞和间质细胞的子宫内膜组织取下，把子宫内膜组织剪成直径大约为2 mm的碎块，放入含有5 mL培养液（DEME/12 20%胎牛血清，100 IU/mL双抗，2.5 μg/mL两性霉素 B）的 6孔板中，在 5%CO2、37℃条件下培养，间隔24 h更换1次培养基，直到进行下一步处理。

1.2.2 形态学观察：为了考查体外培养对子宫内膜活性的影响，将培养10 d后的子宫内膜组织和正常的子宫内膜组织用4%多聚甲醛固定，然后进行HE染色，在显微镜下观察组织形态。

1.2.3 RT-PCR：总RNA提取：将用液氮冻存的、经体外培养10 d后的奶牛子宫内膜组织进行研磨，按照RNA提取试剂盒说明书提供的方法提取组织总RNA，总 RNA 的 OD260nm/OD280nm值在 1.9～2.0。反转录：将总RNA浓度调整至500 ng/μL以下，然后按照反转录试剂盒说明书提供的方法进行RNA反转录，得到cDNA。RT-PCR反应体系见表1。

表1 RT-PCR反应体系

1.2.4 实时荧光定量PCR：使用ABI公司提供的ViiATM7 Real-time PCR检测系统进行实时荧光定量PCR反应，反应体系为25 μL（见表2）。引物序列见表3。实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性 30 s；95℃变性 15 s，58℃退火温度 34 s；72℃延伸 30 s，共40个循环；从 70℃到95℃隔 0.5℃制作融解曲线。

1.2.5 数据处理：以β-actin作为内参基因，通过对目的基因和内参基因进行均一化处理，计算目的基因转录的相对表达量。采用2-ΔCt法计算目的基因的相对表达量，利用目的基因及内参基因Ct值计算ΔCt值，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。

表2 实时荧光定量PCR反应体系

2 结果与分析

2.1 体外培养的子宫内膜组织形态学观察 从外观来看，体外培养的子宫内膜组织结构与正常组织相似。HE染色表明，培养10 d后的子宫内膜组织结构完整（见图1）。纵向切片表明，子宫内膜组织完整且没有肌层，子宫内膜的腺体清晰可见，贯穿子宫内膜。横向切片表明，细胞间距狭窄，细胞连接处可见细胞膜，细胞核完整圆润。

2.2 前列腺素受体的表达 由图2可知，在发情前期的奶牛子宫内膜组织中，PGE2的受体EP4的表达量最高，EP1、EP2、EP3、EP3A、EP3C、EP3D 均有表达，EP3B表达量最低；PGF2α的受体FP也有表达。

3 讨论

子宫内膜的自我修复过程复杂，其包含一系列的生理反应过程。研究表明，PGE2和PGF2α在子宫内膜组织修复过程中可能发挥作用，通过激活PGE2和PGF2α的受体参与组织修复相关因子的调控。在人的子宫内膜上皮细胞中，PGE2能够促进结缔组织生长因子（CTGF）的表达，而CTGF能够促进细胞分化，其在组织生长、伤口愈合、血管发生等过程中发挥重要作用［11］。PGE2在黄体溶解过程中促进FGF-2的表达，FGF-2能够促进新组织的生长［12］。在体外培养的子宫内膜上皮细胞中，PGF2α能够促进VEGF的表达，而VEGF具有促进血管发生、细胞分化以及保护神经的作用［13-14］。在PC细胞抑制前列腺素的合成后，单独给予PGE2，发现PGE2能够促进PC细胞的增殖、黏附、转移和入侵能力［15］。PGE2还可以发挥免疫调节作用，如在机体抵抗病原微生物的侵染过程中发挥作用。以上研究探索了PGE2和PGF2α参与子宫内膜保护和修复过程的可能性，但PGE2和PGF2α在奶牛子宫内膜修复过程中的具体作用还没有被阐明。探究PGE2和PGF2α在子宫内膜修复中的可能作用，首先应明确二者受体在子宫内膜的表达情况。该研究结果表明，奶牛子宫内膜中存在已知的PGE2和PGF2α的所有受体，且不同受体及受体亚型的表达存在差异。有研究证实，在奶牛输卵管中没有EP3的表达，说明在不同组织中，PGE2和PGF2α的受体分布可能有所不同。该研究成功地建立了体外培养奶牛子宫内膜组织的方法。通过RT-qPCR方法检测了PGE2和PGF2α的受体在发情前期奶牛子宫内膜组织中的分布情况，并分析了受体之间表达量的差异。结果表明，PGE2和PGF2α的受体在子宫内膜均有分布，而且受体的表达量存在差异，其中EP4表达量最高，EP1、EP3B的FP的表达量相对较低。

表3 实时荧光定量PCR反应中所用的引物序列

图1 子宫内膜组织体外培养鉴定

图2 奶牛子宫内膜组织中PGE2和PGF2α受体的表达情况

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Establishment of Cultivation Method of Bovine Endometrial Tissue in vitro and Expression of PGE2and PGF2αReceptors

ZHANG Shuang-yi1，2，MAO Wei1，2，LIU Bo1，2，CAO Jin-shan1，2
（1.College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China；2.Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Techniques for Animal Disease，Ministry of Agriculture，Hohhot010018，China）

［Objective］ To establish the cultivation method of bovine endometrial tissue in vitro and to detect the expression of the receptors of PGE2and PGF2αin the cultured endometrium. ［Methods］ The fresh endometrial tissue samples from bilateral uterine horn of health dairy cows in proestrus were collected and used for suspension cultivation in vitro.The cultured endometrium was histologically identified,and the expression of the receptors of PGE2,including EP1,EP2,EP3（EP3A、EP3B、EP3C、EP3D）,EP4,and the receptors of PGE2αFP were evaluated by RT-qPCR. ［Results］ The histological assessment indicated that the structure of cultured bovine endometrium in vitro was intact,and the morphology of the glands and nuclear of the cells was normal.The expression of all the tested receptors of PGE2and PGF2αwere found in the cultured samples from bilateral uterine horn of dairy cows in proestrus.The expression of the receptors varied,the highest relative expression was observed in EP4,and the expression of EP1,EP3B and FP was relatively lower. ［Conclusion］ The in vitro cultivation method of bovine endometrial tissue was successfully established.The expression of the receptors of PGE2and PGF2αwere found in cultured endometrium,and the relative expression of different types of receptors varied.

prostaglandin；PGE2；PGF2α；receptor；RT-qPCR

S859.7；S858.237.23

A文章顺序编号1672-5190（2016）03-0014-04

2016－03－06

项目来源：国家自然科学基金项目（31360627）；内蒙古农业大学科技创新团队项目（NDPYTD2013-1）。

张双翼（1989—），男，硕士研究生，主要研究方向为兽医药理学与毒理学。

曹金山（1973—），男，教授，博士，博士生导师，主要研究方向为兽医药理学与毒理学。

（责任编辑：赵俊利）