微波辅助提取金钗石斛多糖的响应面优化*

荆　晶，王晓红，张倩茹，张婉婷，王　刚

(1.遵义医学院 药学院，贵州 遵义　563099; 2.遵义医学院附属医院 药剂科，贵州 遵义　563099)



技术与方法

微波辅助提取金钗石斛多糖的响应面优化*

荆晶1，王晓红1，张倩茹1，张婉婷2，王刚1

(1.遵义医学院 药学院，贵州 遵义563099; 2.遵义医学院附属医院 药剂科，贵州 遵义563099)

目的 使用响应面法优化微波辅助提取金钗石斛多糖的工艺。方法 金钗石斛多糖提取率为响应值，在单因素实验基础上，以响应面法优化金钗石斛多糖微波辅助提取工艺，采用Box-Behnken进行制备工艺设计，综合分析料液比、提取时间、提取温度因素之间的交互作用对提取率的影响。结果 金钗石斛多糖提取的最优条件是：料液比(A)为1∶28.2，提取时间(B)为10.68 min，提取温度(C)为67.30 ℃，提取率预测值为18.91%。实际平均提取率为19.75%，相对误差小于1%，水提醇沉法多糖提取率(12.38%)之间具有极其显著性差异。结论 微波辅助法能提高金钗石斛多糖提取率，采用响应面法对该方法进行工艺优化，所得工艺条件稳定可靠，方便可行。

金钗石斛；多糖；微波；提取率；响应面分析

金钗石斛(DendrobiumnobileLindl.)为兰科石斛属多种植物的茎[1]。它具有很多药用价值，可“强阴益精，厚肠胃，壮筋骨，暖水脏，补肾益力，轻身延年”[2-3]。金钗石斛是我国珍贵的药材，贵州赤水的金钗石斛是中国国家保护二类珍稀濒危植物[4-5]。金钗石斛的化学成分类型主要有多糖、生物碱、酚、菲类等[6-7]，其中多糖和生物碱是最为重要的活性成分，具有增强免疫、抗菌、抗肿瘤等多种功效[8]。

关于金钗石斛多糖的提取方法，大多采用传统的水提醇沉回流提取法[9]，微波提取是最近几年发展起来的一种方法，与传统方法比较它有许多优点，如耗时少、操作方便且简单、节约溶剂、含量高、选择性好等[10]。刘文等[11]用正交试验设计，研究微波辅助提取金钗石斛工艺，所采用的药材品种和所选择的工艺条件与本文不同，正交试验方案设计可以考察各因素对因变量的影响，但无法考察各因素之间交互作用的综合影响。本文采用单因素实验，确定选取响应面法设计的因素及水平，该设计优化金钗石斛多糖的微波提取工艺，可以更全面考虑各因素之间的交互影响，为金钗石斛药材的合理开发利用及工业化生产提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器金钗石斛(产地：贵州赤水)，无水葡萄糖(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)，硫酸(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)，苯酚(分析纯，广东省汕头市西陇化工厂)，食用酒精，无水乙醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)。

弹簧度盘秤(ATZ-10，南宁市仁和弹簧度盘秤厂)，电子天平(BS110S，北京赛多利斯天平有限公司)，电热恒温水浴锅(DK-2000-L，天津泰斯特仪器有限公司)，电子调温电热套(98-1-B型，天津泰斯特仪器有限公司)，小型粉碎机(XFB-200，长沙市中诚制药机械有限公司)，旋转蒸发器(RE-2000，上海光学仪器厂)，恒温干燥箱(101-4型，重庆市松朗电子仪器有限公司)，紫外分光光度计(T6新世纪，北京普析通用仪器有限公司)，微波萃取仪(XH-100B，北京祥鹄科技发展有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1金钗石斛多糖提取工艺流程药材预处理：新鲜金钗石斛洗净切碎，烘干至恒重，粉碎过筛，得到金钗石斛药材粉末。提取工艺流程：称取2 g药材粉末，按照一定料液比加入纯化水，在微波提取后滤过，再二次提取，合并，浓缩滤液，80%乙醇进行醇沉处理，滤过，恒温干燥后即可得到金钗石斛多糖粗提取物。

1.2.2多糖含量的测定

1.2.2.1标准曲线的绘制精密称取葡萄糖0.1 g加水使溶解，定容于100 mL容量瓶中，可得葡萄糖的标准溶液。分别取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL葡萄糖标准液于10 mL容量瓶中，加苯酚1 mL摇匀，加浓硫酸5 mL，定容至刻度线，放置5 min，沸水浴20 min。以2 mL蒸馏水同法做空白对照，在494 nm处测吸光度[12]。绘制标准曲线，得出回归方程y=13.505x+0.050 2(R2=0.999 2)，表明多糖在0.102～1.224 mg/mL质量浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

1.2.2.2样品多糖含量测定精密吸取金钗石斛多糖提取液1 mL，加5%苯酚1.0、5.0 mL浓硫酸，放冷至室温，以2 mL蒸馏水作空白对照，于494 nm处测定其吸光度值，回归标准曲线，滤液多糖浓度，换算出多糖质量，得到多糖含量[13]。

1.2.3单因素试验单因素试验以金钗石斛多糖含量作为响应值，分别考察微波提取时间、料液比(M/V)、提取温度、微波提取功率、微波前冷浸时间等对响应值的影响。

1.3统计学分析采用Design-Expert 8.05b软件进行数据整理和分析，拟合各因素和响应值(金钗石斛多糖提取率)之间的函数关系，比较各因素对含量的影响。选取料液比、微波提取时间及微波提取温度进行3因素3水平Box-Benhnken的中心组合实验设计，优化微波辅助提取金钗石斛多糖的工艺条件。因素水平设计(见表1)。

表1响应面分析因素与水平

水平因素料液比(A,kg/L)提取时间(B,min)提取温度(C,℃)-11∶2085001∶30106011∶401270

2　结果

2.1单因素试验结果如图1所示，单因素实验得到最佳微波提取时间为10 min，最佳料液比为1∶30，最佳提取温度为60 ℃，最佳微波提取功率为500 w。从选取的4个因素来看，微波提取时间、料液比和提取温度对金钗石斛多糖提取率影响较大，而微波提取功率对多糖提取率的影响比较不显著。

2.2响应面实验如表2所示，一共选择不同条件下的17个实验数据点，其中12个点为析因点，5个为零点，析因点为自变量取值在A、B、C所构成的三维定点；零点为区域的中心点，其中零点实验重复5次，估算试验误差。综合分析表中数据结果得金钗石斛多糖提取率回归方程为Y= +18.54-0.082×A+0.83 ×B+0.76 ×C-0.25×A×B-1.37 ×A×C+0.21 ×B×C-3.79 ×A2-1.69 ×B2-0.77 ×C2。

图1　单因素试验结果

表2响应面分析试验设计及结果

试验号A(kg/L)B(min)C(℃)提取率(%)1-10-112.302-11015.70310114.32400016.88510-118.63600018.82700017.09811013.85900018.901000018.7711-1-1011.761201-113.981301116.52140-1-111.24151-1017.58160-1113.6217-10115.21

表3响应面回归模型方差分析

方差来源平方和自由度均方和FP显著性模型98.543910.94911.5720.0020P<0.05A0.05410.0540.0580.8173P>0.05B5.44515.4455.7550.0475P<0.05C4.62114.6214.8840.0628P>0.05AB0.25510.2550.2700.6196P>0.05AC7.53517.5357.9630.0257P<0.05BC0.18110.1800.1910.6753P>0.05A260.441160.44163.8800.0001P<0.001B212.079112.07912.7670.0091P<0.05C22.48812.4882.6300.1490P>0.05残差6.62370.946失拟项5.43331.8116.0840.0568P>0.05纯误差1.19140.298总和105.16616

2.2.1响应面图与等高线分析根据回归方程得到所优化的3个工艺因素：料液比(A)、提取时间(B)及提取温度(C)之间，A与C交互作用关系最为显著，其次为A与B，B与C之间交互作用不显著。

由图2可知，提取时间与料液比之间的交互作用不显著，在一定料液比条件下，多糖提取率随着微波提取时间的增加，出现先升高后下降的趋势，最初升高比较快，然后随着时间继续增加略有下降趋势。说明提取时间过长，溶液温度过高，会导致已提取多糖发生降解，降低其提取产率。

图2　Y= f (A,B)料液比和提取时间对提取率影响的响应面及等高线

由图3可知，料液比和提取温度之间的交互作用非常显著，温度较低的条件下，随着料液比的增大，提取率快速提高后缓慢下降；在较高温度条件下，随着料液比的增加，提取率缓慢增加后快速下降。

图3　Y= f (A,C)料液比和提取温度对提取率影响的响应面及等高线

由图4可知，提取时间与提取温度之间的交互作用不显著，在一定的提取时间条件下，随着提取温度的增加，提取率稳定在16%～18%，在提取时间为10 min时，提取温度对金钗石斛多糖提取率几乎没有影响。

图4　Y= f (B,C)提取时间和提取温度对提取率影响的响应面及等高线

2.2.2金钗石斛多糖微波辅助提取最佳工艺条件的确定通过Design-Expert软件对实验数据进行分析，得到金钗石斛多糖微波辅助提取最佳工艺条件为：料液比为1∶28.2，提取时间为10.68 min，提取温度为67.30 ℃，预计提取率为18.91%。为了方便实际操作，将实验条件简化为料液比1∶30，提取时间11 min，提取温度65 ℃，取3批样品，进行3次平行提取实验，得到实际平均提取率为19.75%，与预测值之间相对偏差低于1%，因此基于响应面法所得到的微波辅助提取工艺参数可靠，得到的金钗石斛多糖提取条件具有实际应用价值(见表4)。

提取方法提取率(%)样品1样品2样品3平均提取率(%)P微波辅助法19.75±0.1219.87±0.2319.63±0.1519.750.0009水提醇沉法11.88±0.2712.40±0.7812.85±0.6612.38<0.0010

微波辅助法、水提醇沉法各样品组之间比较P>0.05；两种实验方法平均提取率之间比较P<0.001。

2.3水提醇沉法对比实验对同批次金钗石斛样品，采用传统的水提醇沉取法[14]进行了提取实验，平行提取3次，得到平均提取率为12.38%，两种实验方法所得提取率之间差异在0.001水平具有统计学意义，微波辅助法提取率明显高于传统水提醇沉法(见表4)。

3　讨论

金钗石斛中的多糖一般都采用传统的水提醇沉法，但其存在溶剂量消耗大，操作复杂，提取率低等缺点。本实验选用了微波辅助提取金钗石斛中的多糖，以提取率为响应值，在单因素条件下考察了微波温度、微波功率、微波时间和浸提时间对多糖得率的影响[15]。根据单因素实验结果，采用响应面设计法优化了金钗石斛多糖提取工艺，选出了最佳提取工艺条件。同一批次样品通过传统水提醇沉法对金钗石斛多糖的提取率为12.38%[14]，采用响应面优化设计微波辅助提取，平均提取率为19.75%。采用该方法预测结果与实际结果相差较小，且可以综合考虑各因素之间的组合影响，比其他工艺优化方法更为精准高效[16]。因此，本文所得到的微波辅助提取金钗石斛多糖工艺条件，可为石斛多糖的产业化生产及金钗石斛药材的综合利用开发提供理论依据。

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[收稿2016-05-13;修回2015-06-28]

(编辑：王静)

Response surface optimization of microwave-assisted extraction of polysaccharides fromDendrobiumnobileLindl.

JingJing1,WangXiaohong1,ZhangQianru1,ZhangWanting2,WangGang1

(1.Pharmacy School of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective Response surface methodology was utilized to optimize the extraction process of polysaccharide fromDendrobiumnobileLindl (DLP) which could be used for the development ofDendrobiumnobileLindl.Methods The extraction rate of DLP is used to be response value. On the basis of single factors experiment, using response surface method to optimiza the extraction of DLP by microwave-assisted extraction and analysing the interaction of various factors effect on the extraction rate.Results The optimal condition for extraction of DLP is solid-liquid ratio (A) is 1∶28.2, extraction time (B) is 10.68 min, and the extraction temperature(C) is 67.30 ℃. The predicted extraction rate is 18.91% and the actual value is 19.75%. The relative error is less than 1%. And the traditional extracted method reached a significant difference in DLP extraction rate at 12.38%.Conclusion Microwave-assisted methodis superior to the traditional water extraction and alcohol precipitation method in DLP extraction rate, which is stable, reliable, convenient and feasible.

DendrobiumnobileLindl.; polysaccharide; microwave; extraction rate; response surface analysis

国家自然科学基金资助项目(NO：81560569)。

王刚，男，博士，副教授，研究方向：中药活性成分与食品科学，E-mail:wg8855350@163.com。

R283.6

A

1000-2715(2016)04-0418-05