外源一氧化氮对铁皮石斛原球茎生长和多糖积累的影响

李巧自，高素萍，张科燕，陈　锋，段晶晶，蔡心怡

(1.四川农业大学 风景园林学院，四川 成都 611130； 2.四川农业大学 园林研究所，四川 成都 611130)



外源一氧化氮对铁皮石斛原球茎生长和多糖积累的影响

李巧自1，高素萍2，*，张科燕1，陈锋1，段晶晶1，蔡心怡1

(1.四川农业大学 风景园林学院，四川 成都 611130； 2.四川农业大学 园林研究所，四川 成都 611130)

以硝普钠(SNP)为一氧化氮(NO)供体，研究了不同浓度的外源NO对铁皮石斛原球茎生长、叶绿素含量、蔗糖合成酶(SS)活性和多糖积累的影响。结果总体表现为低浓度的SNP有利于铁皮石斛原球茎的生长，而高浓度的SNP可以促进多糖的合成。在添加0.50 mmol·L-1SNP的培养基中培养28 d时其干质量比对照高36.9%，总叶绿素含量在14 d时为对照的1.33倍；在添加1.00 mmol·L-1SNP的培养基中培养7 d时其多糖含量为对照的1.59倍，同时SS活性显著升高。综合多糖产量来看，0.50 mmol·L-1SNP效果最佳，在处理期间显著高于其他处理，且对其干质量、叶绿素含量、SS活性和多糖积累均有促进作用。添加NO清除剂(cPTIO)后，铁皮石斛原球茎的生长、SS活性和多糖合成受到抑制。

铁皮石斛；原球茎；一氧化氮；叶绿素；蔗糖合成酶；多糖

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)花型奇特、高雅芳香，不仅是当今世界上流行的兰花之一，而且因含有多糖等次生代谢物质亦具有较高药用保健价值，近年来市场开发力度越来越大，经济效益凸显。但铁皮石斛生长环境要求苛刻，自然繁殖率低，且多年过度采挖，造成野生铁皮石斛资源日趋减少[1]。目前生产原料主要来自组织培养，因试管苗移植成功率不高，炼苗周期长等多方因素造成产品市场价格昂贵。因此，寻找一种快速高效生产铁皮石斛多糖的途径显得尤其重要。原球茎(protocorm-like bodies，PLBs)是离体培养产生的组织，具有增殖效率高、生长周期短，可实现规模化生产的特点，并具备与原植物同样的形态发育和物质代谢潜能[2]。有文献报道铁皮石斛原球茎同原药材多糖含量非常接近，且药理作用相同[3-4]。如果铁皮石斛原球茎能部分替代原植物成为药源，这将对铁皮石斛资源的保护、开发利用具有重要现实意义。

已有研究表明，一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物体内的一种广泛分布的气体信号转导分子，参与植物的生长发育、光合作用、光形态建成、胁迫反应等多种生理代谢过程，并调控植物体内次生代谢产物的合成[5-6]。 Leshem等[7]发现，外源NO处理可促进豌豆叶片的扩大。An等[8]在研究NOS(一氧化氮合酶)和β-葡聚糖酶的关系时发现，利用NOS抑制剂处理可以使叶片β-葡聚糖酶的活性和生物量降低，而SNP(NO供体sodium nitroprusside)能使叶片β-葡聚糖酶活性增强并使生物量升高。Modolo等[9]发现外源NO可以提高大豆甙元、大豆抗毒素和黄酮类物质的含量。在此基础上，张磊等[10]进一步研究表明在光照胁迫下外源添加SNP有利于提高人参愈伤组织中皂苷和多糖的含量。由此推测，NO可能通过介导生物和非生物诱导子诱发植物细胞的防御反应，激活细胞中次生代谢产物的合成代谢途径。对铁皮石斛原球茎多糖积累而言，这种作用是否存在？NO在整个代谢过程中是否起到信号作用或是其他作用，这是一个值得探究的问题。

1　材料与方法

1.1试验材料

供试材料铁皮石斛原球茎已经过30～40次继代培养(每40 d继代一次)，具有稳定的形态特征和生长速率。由四川农业大学风景园林工程重点实验室提供。

1.2试验方法

1.2.1培养基制备

以MS培养基为基本培养基，附加蔗糖30 g·L-1，琼脂7 g·L-1，pH值调至5.8。在121 ℃高温高压灭菌锅内持续灭菌17 min。

1.2.2试验处理

添加不同浓度的NO供体硝普钠SNP(sodium nitroprusside)和一定浓度的NO清除剂cPTIO(carboxyl-phenyltetramethylimidazole oxide)处理铁皮石斛原球茎，试验设计见表1。SNP 和cPTIO溶液经0.22 μm滤膜进行过滤灭菌后加入培养基中待用。另外，加入等体积的蒸馏水作为对照处理(CK)。选择长势均一、色泽鲜绿材料接入到组织培养瓶中，每瓶2.0 g。培养条件为：光周期12 h·d-1，光强2 000 lx，昼/夜温度为25 ℃/15 ℃。试验共6个处理，每处理3次重复。分别在处理0，7，14，21，28 d后测定各项指标。

1.2.3铁皮石斛原球茎生长及生理指标的测定

生物量及其测定方法：取出各处理的铁皮石斛原球茎，洗净培养基，用滤纸吸干水分后称取其鲜质量，然后在烘箱中以105 ℃杀青20 min后以60 ℃烘至恒重，称取其干质量，根据下式计算相对生长速率。

相对生长速率(%)

表1试验设计

Table 1The experimental design

编号处理CK0mmol·L-1SNPT10.25mmol·L-1SNPT20.50mmol·L-1SNPT31.00mmol·L-1SNPT42.00mmol·L-1SNPT5xmmol·L-1SNP+ymmol·L-1cPTIO

注：其中T5为本次试验的验证试验，xmmol·L-1SNP为试验最后得出的最适外源NO浓度(0.50 mmol·L-1)，ymmol·L-1cPTIO为对应的cPTIO浓度(5 mmol·L-1)。

叶绿素含量及其测定方法参见李合生的丙酮浸提法[11]。取不同处理的铁皮石斛原球茎鲜样0.1 g，放入10 mL离心管中，加入5 mL 80%丙酮溶液在黑暗条件下浸提48 h直至完全变白，取上清液在645和663 nm下测定吸光度，并计算出溶液中叶绿素a，b及(a+b)的含量。

蔗糖合成酶活性的测定采用滕建北等[12]的方法并做适当调整。取0.5 g原球茎鲜样，加入5 mL提取介质(100 mmol·L-1pH 7.2 Tris-HCl，10 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1EDTA-Na2，10 mmol·L-1DTT，2%乙二醇)于研钵中磨成匀浆后，倒入离心管，在低温冷冻超速(12 000 r·min-1)离心机上离心10 min，取上清液进行酶活性测定。以上提取过程均在4 ℃下进行。每一处理取4支试管，各加入0.1 mL酶液(对照加0.1 mL 2 mol·L-1NaOH)，加入0.4 mL合成反应介质(100 mmol·L-1pH 7.2 Tris-HCl，10 mmol·L-1MgCl2，5 mmol·L-1UDPG，5 mmol·L-1D-果糖)，30 ℃水浴30 min后，沸水浴5 min，加0.1mL 2 mol·L-1NaOH混匀，再沸水10 min冷却，加入1 mL 0.1%间苯二酚和3.5 mL 30%盐酸，摇匀，80 ℃水浴10 min，冷却至常温，480 nm处比色测定酶活性，单位用μg·g-1·h-1表示。

多糖的提取参照叶余原[13]的超声法，稍加调整。先将各处理的原球茎洗净，在烘箱中105 ℃杀青20 min后以60 ℃烘48 h至恒重，然后研磨过40目。称取干品粉末约0.1 g，用滤纸包好后置于三角瓶中，依次用石油醚(60～90 ℃)、80%乙醇(80 ℃)在水浴中回流提取去除干扰杂质成分，而后取出样品，滤纸包置于105 ℃烘箱中干燥(约30 min)。将净化后原球茎粉末放入进试管中，每管加入10 mL蒸馏水，放入KQ-300GVDV型三频恒温数控超声波清洗器中，用超声波水浴加热提取(超声波功率恒定为300 W)多糖。水位保持在刚好淹没试管10 mL刻度线处，温度80 ℃，持续提取4 h。多糖测定参照李满飞等[14]的苯酚硫酸法，因浓硫酸使多糖降解为葡萄糖，其他试剂与葡萄糖作用从而达到显色的目的，因此试验采用葡萄糖作为对照。

1.3数据分析处理

试验数据采用Excel 2010进行数据分析及作图，用SPSS 17.0进行方差分析(P<0.05)。

2　结果与分析

2.1外源NO对铁皮石斛原球茎生长的影响

由图1可知：随着培养时间的增加，各个处理下的原球茎干质量均表现出上升的趋势。而添加不同浓度的SNP对铁皮石斛原球茎生长的影响不同，低浓度的SNP(0.25 mmol·L-1)处理下促进了其生长，高浓度的SNP(1 mmol·L-1)处理下却抑制了其生长。浓度0.50 mmol·L-1SNP对生长促进效果最显著，当培养到28 d时，其干质量高出对照36.9%。0.50 mmol·L-1SNP+5 mmol·L-1cPTIO处理下与CK差异不显著。

图2表明：随着培养时间的增加，各处理下原球茎的相对生长速率呈现出先升高后降低的趋势，在14～21 d，相对生长速率达到最大。与对照相比，0.25和0.50 mmol·L-1SNP均促进了其生长，其中0.50 mmol·L-1SNP处理下显著高于对照，为对照的1.14倍；1.00 mmol·L-1SNP处理则抑制了其生长。添加cPTIO的处理与对照无显著性差异。由此可见，外源NO对铁皮石斛原球茎生长的有效性。其一表现在对其生物量增长的低促高抑，对其相对生长速率先快后慢上。而生物量增长快慢与相对生长速率存在一种正相关关系。其二表现在外源NO促进原球茎生物量增加的浓度适宜性，也就是说外源NO浓度与生物量增加并非是正相关关系，只有适宜的浓度才能表现出生物量的最大积累。

同一培养时间不同处理间没有相同字母表示在0.05水平差异显著。下同。图1　不同培养时间不同浓度外源NO处理对铁皮石斛原球茎干重的影响Fig.1　Effect of different culture time with different concentrations of exogenous NO treatment on dry weight of Dendrobium officinale

图2　不同培养时间段不同浓度的外源NO处理对铁皮石斛原球茎相对生长率的影响Fig.2　Effect of different culture time with different concentrations of exogenous NO treatment on relative growth rate of Dendrobium officinale

由表2可知：不同处理下铁皮石斛原球茎叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量随时间的增加呈现出先上升后下降的趋势，在14 d时达到最大。同时，叶绿素含量随着SNP浓度的升高，也出现先增加后减少的现象。其中0.50 mmol·L-1SNP处理的促进作用最明显，叶绿素a为对照的1.30倍，叶绿素b达到对照的1.38倍，总叶绿素含量则是对照的1.33倍。1.00 mmol·L-1SNP处理则对叶绿素含量有抑制作用。cPTIO+SNP处理和对照差异不显著。

2.2外源NO对铁皮石斛原球茎蔗糖合成酶活性的影响

试验结果表明：适宜浓度的SNP处理均提高了蔗糖合成酶活性，并且在第7天时达到最大值。其中0.50和1.00 mmol·L-1SNP处理效果均较好，皆为对照的2倍，这2个处理之间差异不显著。而添加cPTIO处理与对照无显著性差异(图3)。说明外源NO对蔗糖合成酶活性的影响较大，在适宜浓度时可显著提高蔗糖合成酶活性。

2.3外源NO对铁皮石斛原球茎多糖含量及产量的影响

从图4-A可看出：与对照相比，不同浓度的SNP对多糖含量的影响与SS活性相似，且在第7天达到最大值。0.50和1.00 mmol·L-1SNP处理对多糖含量有明显促进作用，在处理第7天分别是对照的1.56倍和1.59倍，添加cPTIO显著抑制了0.50 mmol·L-1SNP的促进作用。

表2不同培养时间不同浓度外源NO处理对铁皮石斛原球茎叶绿素含量的影响

Table 2Effect of different culture time and different concentrations of SNP treatment on chlorophyll content ofDendrobiumofficinale

叶绿素含量/(μg·g-1)处理处理时间/d07142128ChlaCK10.94±1.14a15.70±0.25bc25.67±0.67bc23.71±0.38bc21.93±0.22bcT110.97±3.82a16.70±0.26b27.78±0.91b25.89±0.62b23.09±0.06bT210.82±1.37a18.64±0.99a33.23±2.94a30.23±0.40a25.83±0.53aT311.01±0.65a14.96±0.65c24.50±0.54cd22.36±0.81cd20.79±0.79cdT411.33±1.09a13.40±0.61d22.43±0.40d20.74±0.14d19.13±0.14dT510.78±1.32a15.96±0.84bc25.78±0.51bc23.60±0.44bc22.19±0.82bcChlbCK10.42±0.73a14.31±1.28bc21.15±1.45cd19.46±0.79b18.93±0.78abT110.61±3.77a15.00±0.91ab25.88±2.53b20.34±2.01b20.55±0.65aT210.30±0.96a16.91±0.97a29.11±1.64a25.21±0.74a21.19±2.14aT310.22±0.19d13.82±1.68c19.10±0.48d16.72±0.93c16.74±1.16bT410.69±1.42b12.66±0.89c19.00±0.09d17.13±1.37c17.82±1.15bT59.37±0.98e14.35±1.07bc22.89±0.84c20.01±0.88b18.08±1.09bChl(a+b)CK21.35±1.87a30.00±1.45b46.80±2.08cd43.15±0.99c40.86±1.00cT121.58±7.59a31.23±1.43b53.65±3.42b46.22±2.42b43.64±0.59bT221.11±2.33a35.54±1.96a62.34±4.59a55.43±0.37a47.01±2.13aT321.23±0.72a28.77±2.26bc43.59±0.63de39.06±1.47d37.53±1.93deT422.02±2.48a26.05±1.49c41.12±0.36e37.86±1.47d36.95±1.29eT520.99±2.30a29.28±1.80bc48.63±1.20c43.59±1.25c40.26±1.84cd

注：Chla，叶绿素a含量；Chlb，叶绿素b含量；Chl(a+b)，总叶绿素含量。表中同一指标同列数据后没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

图3　不同培养时间不同浓度外源NO处理对铁皮石斛原球茎蔗糖合成酶的影响Fig.3　Effect of different culture time and different concentrations of exogenous NO on sucrose synthase activity of Dendrobium officinale

图4　不同培养时间不同浓度外源NO处理对铁皮石斛原球茎多糖含量和多糖产量的影响Fig.4　Effect of different culture time and different concentrations of exogenous NO on polysaccharide content and yield of Dendrobium officinale

如图4-B所示：随着培养时间的增加，铁皮石斛原球茎多糖产量呈逐渐升高的趋势，而0.50 mmol·L-1SNP处理显著高于其他各处理。在培养到21 d时，该处理多糖产量为对照的1.4倍。而添加cPTIO却表现出明显的抑制作用，和对照差异不显著。由此可见，适宜的外源NO浓度可促进多糖含量与产量的增加。多糖含量达峰值时间比产量达峰值时间提前。前者的变化规律与SS活性变化相似。

3　讨论

NO已被证实是植物中的一种新型信号分子。近年来有一些研究报道NO参与了生物胁迫和非生物胁迫诱导的药用植物次生代谢产物的合成调控[15]。徐茂军等[16]研究证明，外源NO 单独处理可以促进红豆杉细胞中紫杉醇合成。郝岗平等[17]研究表明：低浓度(0.5 mmol·L-1)SNP有利于银杏悬浮细胞生长，而高浓度(10 mmol·L-1)SNP可以促进黄酮类物质的合成。由此看来，本试验结果与前人研究结果大致相同，但SNP具体作用浓度却不相同，可能是由于不同植物及次生代谢产物对SNP的反应不同。本次试验结果表明：低浓度的SNP(0.25 mmol·L-1)有利于铁皮石斛原球茎生长，高浓度的SNP(1.00 mmol·L-1)有利于多糖含量的增加，0.50 mmol·L-1SNP对铁皮石斛原球茎的生长和多糖含量的增加均有促进作用，使得多糖产量最高，为最佳的处理浓度。SNP对铁皮石斛原球茎生长和多糖积累的促进作用又可以被NO清除剂cPTIO所抑制，表明这种促进作用确实是由SNP分解所产生的NO带来的。

试验结果显示：0.50 mmol·L-1SNP处理下，铁皮石斛的相对生长率明显提高，有利于铁皮石斛生长量的积累。叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，其含量大小直接影响了光合作用强度，从而影响植物的生长。前人的研究也表明：适宜浓度的SNP有利于促进霍山石斛叶绿素含量的增加[18]，还可以通过诱导PSⅡ天线系统对过剩光能的热耗散来避免豌豆叶片光破坏的发生[19]。我们的试验发现，适宜浓度(0.50 mmol·L-1)的SNP对叶绿素含量有明显促进作用。并且SS活性及多糖含量均在SNP处理7 d达到最大，并且其变化规律也一致，证明NO通过增加铁皮石斛原球茎叶绿素含量，使光合作用增强，进一步促进了蔗糖等碳水化合物的积累，蔗糖在SS的作用下分解成葡萄糖、果糖等，为多糖合成提供前体物质，最终促进了多糖的合成。这在光合生理层面上解释了NO促进多糖合成的原因。

李运合等[20]研究成果表明，40 μmol·L-1的SNP处理能促进玉米幼苗叶片的脯氨酸、蔗糖和可溶性总糖的大量积累，促进蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖合成酶(SS)活性的提高。本试验中适宜浓度(0.50 mmol·L-1)的SNP对铁皮石斛原球茎的SS活性有明显提高作用，且促进了多糖的合成。这可能是因为外源NO一方面可作为信号分子提高SS活性，促进蔗糖的吸收与分解，提高铁皮石斛原球茎胞内果糖和葡萄糖的含量，改善铁皮石斛原球茎对碳源的利用，从而促进多糖的合成。另一方面还可通过促发铁皮石斛原球茎的防御反应，使得蔗糖、果糖、葡萄糖等可溶性糖积累，为多糖的合成提供了前体物质从而有利于多糖的合成，最终促成了多糖的积累。为此，本试验结果证明了外源NO对铁皮石斛原球茎生长和多糖积累的有效性。其作用机制亦或是光合生理与信号作用的综合结果，这点还需进一步试验加以证明。

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(责任编辑张韵)

Effects of exogenous nitric oxide on growth and polysaccharide accumulation of protocorm-like bodies from Dendrobium officinale

LI Qiao-zi1，GAO Su-ping2，*，ZHANG Ke-yan1，CHEN Feng1，DUAN Jing-jing1，CAI Xin-yi1

(1.CollegeofLandscapeArchitecture，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.InstituteofLandscapeArchitecture，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

Sodium nitroprusside(SNP) was used as nitric oxide(NO) donor， the effects of different concentrations of exogenous NO on the protocorm-like bodies(PLBs) fromDendrobiumofficinale， including the growth， chlorophyll content， the activity of sucrose synthase (SS) and the accumulation of polysaccharide were studied. The results showed that a low level of SNP was beneficial for the growth of protocorm-like bodies， but the high level of SNP could promote the synthesis of polysaccharide. The dry weight of PLBs cultured in 0.50 mmol·L-1SNP medium was 36.9% more than its control on the 28th day， and the total chlorophyll content on the 14th day was 1.33 times of the control. The polysaccharide content in the treatment of 1.00 mmol·L-1SNP was 1.59 times of the control， while the activity of sucrose synthetase significantly increased. Taken together， 0.50 mmol·L-1SNP showed the best effect， which could promote the dry weight， chlorophyll content， sucrose synthetase activity and the content of polysaccharide， and the above indexes were significantly higher than other treatments. While cPTIO， nitric oxide scavenger， was added， the growth of PLBs， sucrose synthase activity and polysaccharide accumulation were all inhibited.

Dendrobiumofficinale；protocorm-like bodies；nitric oxide；chlorophyll；sucrose synthase；polysaccharide

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.09

四川农业大学国家级创新训练项目(201410626015)

李巧自(1995—)，女，四川德阳人，研究方向为药用植物次生代谢。E-mail: L92_liqiaozi@163.com

，高素萍， E-mail: gsp65@163.com

S567

A

1004-1524(2016)04-0595-06

李巧自，高素萍，张科燕，等. 外源一氧化氮对铁皮石斛原球茎生长和多糖积累的影响[J].浙江农业学报，2016，28(4)： 595-600.

收稿时期：2015-09-21