小麦优质亚基和抗白粉病Pm4a基因聚合体的PCR鉴定

刘永安， 潘彬荣， 岳高红， 梅喜雪， 许立奎，*， 张宗宸， 周志辉

(1.浙南作物育种重点实验室， 浙江 温州 325006； 2.温州市农业科学研究院 作物研究所，浙江 温州 325006)



小麦优质亚基和抗白粉病Pm4a基因聚合体的PCR鉴定

刘永安1，2， 潘彬荣1，2， 岳高红1，2， 梅喜雪2， 许立奎1，2，*， 张宗宸1，2， 周志辉1，2

(1.浙南作物育种重点实验室， 浙江 温州 325006； 2.温州市农业科学研究院 作物研究所，浙江 温州 325006)

为选育优质、高产、抗病的小麦品系(种)，以含1Dx5+1Dy10亚基的宁春4号和含Pm4a抗白粉病基因的扬麦19为亲本，从其杂交F2后代 1/3～1/2粒种子提取DNA，并利用1Dx5亚基和Pm4a基因的特异标记对其进行PCR鉴定。结果表明：在100粒F2代种子中，有51粒种子被鉴定为1Dx5亚基和Pm4a基因聚合体。该试验采用的PCR鉴定，克服了SDS-PAGE电泳耗时多、容易对迁移率相近亚基做出误判的缺点，同时也摆脱了白粉病大田和温室鉴定时受气候条件和农时的限制，大大提高了鉴定的效率和准确性。对中选的聚合体做进一步鉴定，有望选出农艺性状好、产量高、品质优、抗白粉病的小麦品系。

小麦；高分子量谷蛋白亚基；白粉病；聚合体；聚合酶链式反应(PCR)

小麦的蛋白质含量通常为10%～15%[1]，主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白组成[2]。其中，醇溶蛋白和谷蛋白为小麦种子的主要储藏蛋白，醇溶蛋白赋予小麦面团的延展性，而谷蛋白赋予小麦面团的弹性，二者的共同作用是使小麦面团具有与水稻、玉米等谷物显著不同的加工品质，即具有延弹性[3-4]。根据分子量的大小，小麦谷蛋白又可分为高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)。在六倍体小麦中，HMW-GS由分别位于1A，1B和1D染色体长臂上的Glu-1A，Glu-1B 和 Glu-1D位点编码，每一位点由编码分子量较大的x亚基基因和分子量较小的y亚基基因构成[3-4]。尽管HMW-GS含量只占小麦籽粒蛋白质总含量的12%左右[4]，但其对面包、馒头、面条等食品的加工品质影响很大，其中对面包加工品质的贡献率高达70%左右[3]。因为HMW-GS为储藏蛋白，编码HMW-GS的基因发生突变对小麦的萌发影响不大，所以HMW-GS具有丰富的多态性。研究表明，不同的HMW-GS对面团加工品质的影响也明显不同。在目前已知的HMW-GS中，紧密连锁的1Dx5+1Dy10亚基为公认的优质亚基，含有1Dx5+1Dy10亚基基因的小麦品种，其食品加工品质也往往较优。因此，筛选含有1Dx5+1Dy10亚基基因的植株是小麦品种改良的重要手段之一。

小麦白粉病是由Blumeriagraminisf. sp.Tritici引起的一种真菌病害，通常情况下可使小麦减产5%～34%[5-6]，重者甚至绝收。在水肥条件好、偏施氮肥、种植密度大的田块，由于通风透光条件较差，湿度大，真菌孢子很容易萌发，造成白粉病的发生。目前，防治小麦白粉病的措施主要有种植抗病品种、改善栽培条件、清除自生苗以及药剂防治[7-8]。其中，种植抗病品种是最为经济有效的手段。然而，随着生理小种的变化，一些抗病品种对白粉病逐渐丧失了抗性。研究表明，Pm2，Pm4a，Pm4b，Pm12，Pm13，Pm16，Pm18～Pm21，Pm5+6等基因仍具有较强的抗性[9]，可作为白粉病抗性基因加以利用。

小麦为浙江省重要的旱粮作物，发展小麦生产对充分利用冬闲田、稳定粮食生产面积和产量、保障粮食安全有着重要意义。然而，浙江省属于亚热带季风气候，温暖湿润，潮湿多雨，光照相对不足。一方面在小麦生长期间，特别是中后期容易发生白粉病等病害，致使小麦千粒重降低，产量下降；另一方面籽粒蛋白质的积累也受到影响，食品加工品质普遍较差，如用这种面粉制成的面条容易断条、馒头没有嚼劲，这些不利因素严重制约了种植小麦的经济效益，降低农民的种粮积极性。因此，将优质亚基基因、抗白粉病抗性基因导入到浙江省主栽品种中去，对提高浙江省小麦品质和抗性有着重要的意义。

1　材料与方法

1.1试验材料

本研究所用的试验材料为宁春4号、扬麦19、二者杂交F2代分离群体以及中国春(CS)(作对照)。其中，宁春4号含有1Ax1，1Bx17+1By18和1Dx5+1Dy10优质亚基基因，该品种综合性状好，高产稳产，感白粉病，但具有耐病性，在我国西北春麦区推广30多年而不衰，是一个优异的种质资源[10]，在本研究中用作父本；扬麦19含有Pm4a抗白粉病基因，分蘖力较强，成穗率较高，为我国长江中下游冬小麦区的主推品种[11]，在本研究中用作母本。

1.2试验方法

1.2.1DNA的提取

参照刘永安等[12]的无氯仿提取小麦半籽粒DNA的方法，只是在研磨过程中改用高通量组织研磨仪研磨样品。

1.2.21Dx5+1Dy10优质亚基和Pm4a基因的PCR鉴定

考虑到1Dx5亚基基因与1Dy10亚基基因紧密连锁，本研究只对1Dx5亚基基因进行PCR鉴定。PCR反应体系为25 μL，其中含模板DNA 1 μL，10×Buffer(100 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.3， 500 mmol·L-1KCl)2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)5 μL，dNTP Mixture(每组分浓度为10 mmol·L-1)2 μL，每种引物(10 μmol·L-1)各1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.3 μL。反应体系中各试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，引物也由该公司合成，其序列及预扩增片段见表1。反应条件为：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，60 ℃(1Dx5)或56 ℃(Pm4a)退火1 min，72 ℃延伸50 s，35个循环，最后72 ℃再延伸5 min。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

表1引物序列及其预扩增片段

Table 1The primers and target sequences

引物名称序列(5'-3')扩增片段大小/bp基因位点P1P2GCCTAGCAACCTTCACAATCGAAACCTGCTGCGGACAAG-3'[13]450/-1Dx5+/-P3P4GTGGTGTATCAAATGTCATCAGTACTACTCCAGTGACCCCATCTGCTCATAC-3'[14]470/-Pm4a+/-

注：+表示含目的基因；-表示不含目的基因。

1.2.3宁春4号和扬麦19 HMW-GS的SDS-PAGE电泳鉴定

为验证宁春4号种子含有1Dx5+1Dy10优质亚基基因的真实性及PCR鉴定的可靠性，同时也为了解扬麦19 HMW-GS的组成，对宁春4号和扬麦19进行SDS-PAGE电泳鉴定。HMW-GS的提取参照徐黎黎等[15]的方法，采用不连续SDS-PAGE电泳，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12.5%，二者交联度均为3.33%，考马斯亮蓝染色；扬麦19亚基组成分析采用Payne等[16]建立的系统。

2　结果与分析

2.11Dx5和Pm4a基因的PCR鉴定结果

图1-A所示：宁春4号可扩增出450 bp条带，而扬麦19未扩增出该条带，说明宁春4号含有1Dx5亚基基因。图1-B所示：扬麦19可扩增出470 bp条带，而宁春4号未扩增出该条带，说明扬麦19含有Pm4a基因。

2.2宁春4号和扬麦19 HMW-GS的SDS-PAGE电泳鉴定结果

由图2所示：宁春4号的HMW-GS组成为1Ax1，1Bx17+1By18，1Dx5+1Dy10，扬麦19的HMW-GS组成为Null，1Bx7+1By9，1Dx2+1Dy12，说明本研究所用的宁春4号种子确实含有1Dx5+1Dy10优质亚基，同时也说明PCR鉴定1Dx5亚基的结果是可靠的。不过，从图2也可发现，1Dx2与1Dx5亚基的迁移率比较相似，而1Dy10与1Dy12的迁移率则更相近，在用SDS-PAGE电泳鉴定它们时会容易造成误判，尤其是上样量大的情况下，电泳条带就会变宽(如泳道2)，亚基之间的差异就更会被掩盖。因此，用SDS-PAGE电泳鉴定小麦种子是否含1Dx5+1Dy10亚基结果的准确性不如PCR鉴定，即鉴定1Dx5+1Dy10亚基是否存在时最好采用PCR进行鉴定。

M： Marker；1： 宁春4号；2： 扬麦19。图1　1Dx5亚基基因(A)和Pm4a基因(B)的PCR检测结果Fig.1　Agarose gel electrophoresis of PCR product of 1Dx5 subunits (A) and Pm4a (B)

CS： 中国春；1和2： 宁春4号；3和4： 扬麦19。图2　宁春4号和扬麦19号高分子量谷蛋白亚基SDS-PAGE电泳检测结果Fig.2　SDS-PAGE electrophoresis of HMW-GS of Ningchun 4 and Yangmai 19

2.3宁春4号和扬麦19 F2分离群体PCR检测结果

图3-A所示：泳道2，4～6，8～11，13，15和18可扩增出450 bp条带，说明这11粒F2代种子含有1Dx5亚基基因，而其他7粒种子不含该基因，但却是1Dx2亚基的纯合体。图3-B所示：泳道1～3，6～9，11，12，14～18可扩增出470 bp条带，说明这14粒F2代种子含有Pm4a基因，而其他4粒种子不含该基因，但却是隐性基因纯合体。由于图3-A和图3-B中编号相同的泳道检测的是同一粒种子，据此可从图3中看出，泳道2，6，8，9，11，15和18共7粒种子同时含有1Dx5亚基基因和Pm4a基因，即为我们所需的聚合体。

M: Marker; 1-18: 部分F2分离群体。图3　宁春4号×扬麦19部分F2分离群体5亚基(A)和Pm4a基因(B)PCR检测结果Fig.3　Agarose gel electrophoresis of PCR product of 5 subunits (A) and Pm4a gene (B) of some F2 segregation population from Ningchun 4×Yangmai 19

3　讨论

SDS-PAGE电泳是鉴定HMW-GS的常用方法，其原理简单，易于初学者掌握，可以从整体上了解样品的亚基组成。SDS-PAGE电泳比较耗时，整个鉴定过程需要灌制分离胶、浓缩胶，样品HMW-GS的提取，长时间的电泳、染色和脱色等步骤，这通常要花费1～2 d的时间。同时，该方法容易对迁移率相近的不同亚基做出误判，在上样量大的情况下，电泳条带变宽，亚基之间的差异就更容易被掩盖。在本研究中，如果杂交后代为1Dx5+1Dy10亚基基因和1Dx2+1Dy12亚基基因的杂合体时，就很难判断其是杂合体造成的条带变宽或是由于上样量大造成的条带变宽。PCR鉴定是根据不同HMW-GS序列的差异设计特定的引物，对小麦基因组DNA进行PCR扩增，该方法高效快捷，克服了SDS-PAGE电泳的耗时多、容易误判迁移率相近亚基等缺点。如本研究用引物P1和P2扩增含有1Dx5亚基基因宁春4号及部分F2后代个体时，则会有450 bp条带，而扩增不含1Dx5亚基基因的扬麦19及部分F2后代个体时，则没有450 bp的目标条带，即将SDS-PAGE电泳时1Dx2亚基与1Dx5亚基相近的迁移率转变为450 bp条带有和无，其鉴定的准确性大大提高。

虽然1Dx5亚基基因与1Dy10亚基基因紧密连锁，但在宁春4号与扬麦19杂交F2代群体仍会有极小的概率出现1Dx5+1Dy12亚基的个体，仅用1Dx5亚基基因的分子标记进行鉴定时，就有可能将1Dx5+1Dy12亚基的个体误判为含1Dx5+1Dy10亚基的个体。不过，有研究表明，含有1Dx5+1Dy12亚基的小麦品种(系)也具有优良的食品加工品质[17]。因此，只用1Dx5亚基的分子标记进行鉴定就能满足育种工作的需要。

小麦白粉病抗性鉴定常在温室、大田进行。其中，大田鉴定费用较低，但会受到当地气候条件(温度、湿度、光照等)的限制，鉴定结果不稳定；温室鉴定的结果要好于大田鉴定，但需要投入大量资金安装控温、控湿、控光等设备。本研究从1/3～1/2粒小麦种子中提取DNA，可随时对抗白粉病Pm4a基因进行PCR鉴定，其鉴定效率大大提高，而且还摆脱了农时和气候条件的限制。

本研究对100粒扬麦19×宁春4号F2代种子进行了PCR鉴定，从中筛选出51粒1Dx5亚基基因和Pm4a基因聚合体。然而，本研究所用1Dx5亚基基因和Pm4a基因的分子标记只能鉴定其是否存在，而不能区分所鉴定的籽粒是纯合体还是杂合体。根据孟德尔的自由组合定律推测，在本研究所筛选出的51粒聚合体中，可能仅有5～6粒为1Dx5亚基基因和Pm4a基因的纯合体，而其他45～46粒则为杂合体，其后代会发生分离。因此，还需对这些聚合体品质、抗病性以及农艺性状和产量等作进一步鉴定，从中选出农艺性状好、产量高、品质优、兼具白粉病抗性和耐性的小麦品系。

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(责任编辑张韵)

PCR identification of the wheat polymers with high quality subunit and powdery mildew resistance Pm4a gene

LIU Yong-an1，2，PAN Bin-rong1，2，YUE Gao-hong1，2，MEI Xi-xue2，XU Li-kui1，2，*，ZHANG Zong-chen1，2，ZHOU Zhi-hui1，2

(1.KeyLaboratoryofCropBreedingSouthZhejiang，Wenzhou325006，China; 2.InstituteofCropResearch,WenzhouAcademyofAgriculturalSciences，Wenzhou325006，China)

In order to improve the quality， yield and disease resistance of wheat lines (varieties)， Ningchun 4， and Yangmai 19 which have 1Dx5+1Dy10 subunit andPm4apowdery mildew resistance gene were used as parents in present study， respectively. Genomic DNA was extracted from the 1/3-1/2 grain endosperm of their F2individuals. PCR identification was conducted with the specific markers of 1Dx5 subunit andPm4agenes. The results showed that 51 seeds were identified as 1Dx5 subunit andPm4agene polymers among 100 F2individuals. PCR identification used in present study could overcome the time consuming and being easy to confuse the subunits with similar migration rate of SDS-PAGE electrophoresis， get rid of the restrictions of climate and farming season of field and greenhouse identification， and improve the efficiency and accuracy of identification greatly. With further evaluation of the selected polymers， the lines with good agronomic traits， high yield and quality， resistance to powdery mildew would be hopefully developed.

wheat; high molecular weight glutenin subunit (HMW-GS); powdery mildew; polymer; PCR

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.01

2015-11-05

浙江省旱作粮油科技创新团队项目(2011R50026-13)；浙江省重大科技专项农业项目(2012C12902-2-3)；温州市种子种苗科技创新专项(N20120023)；浙江省教育厅一般科研项目(Y201533916)；温州市科技计划项目(N20140031)

刘永安(1980—)，男，河南太康人，博士，讲师，从事小麦、甜糯玉米遗传育种研究。E-mail: liuanliuan123@163.com

，许立奎，E-mail: lkxu@163.com

S512.1

A

1004-1524(2016)04-0545-05

刘永安， 潘彬荣， 岳高红，等. 小麦优质亚基和抗白粉病Pm4a基因聚合体的PCR鉴定[J].浙江农业学报，2016，28(4)： 545-549.