慢性阻塞性肺疾病激素不敏感与糖皮质激素受体核内转移的相关性

孙筱茹　董　年　袁弘蕾　苏孝琼　王向东　陈智鸿△

(1复旦大学附属中山医院呼吸科　上海　200032; 2 浙江大学医学院附属第二医院感染科　杭州　310009;3 复旦大学附属中山医院实验研究中心　 上海　200032)



慢性阻塞性肺疾病激素不敏感与糖皮质激素受体核内转移的相关性

孙筱茹1,2董年1袁弘蕾1苏孝琼1王向东3△陈智鸿1△

(1复旦大学附属中山医院呼吸科上海200032;2浙江大学医学院附属第二医院感染科杭州310009;3复旦大学附属中山医院实验研究中心 上海200032)

目的研究慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease,COPD)对糖皮质激素不敏感是否与糖皮质激素受体 (glucocorticoids receptor,GRα)的核内转移有关。方法将来自12例健康人、15例轻中度哮喘患者和15例COPD患者的人外周血单个核细胞 (peripheral blood molecule cells,PBMC)进行体外培养。ELISA方法检测其IL-8蛋白质水平,并计算地塞米松 (Dex)半抑制浓度。PBMC在Dex中培养0.5～6 h,通过Western blot检测GRα蛋白质水平,GRα的核内转移则通过免疫荧光和共聚焦显微镜来观测和分析评估。结果COPD患者PBMC较轻中度哮喘患者和健康志愿者对Dex相对不敏感。Dex半抑制率 (IC50Dex)与糖皮质激素受体GRα核内转移呈负相关 (r=-0.54,P=0.000 8)。Dex可诱导增加各组PBMC中的总GRα,但GRα胞内分布各组间存在差异。Dex可明显增加健康人及哮喘患者核内的GRα,但并未增加COPD患者核内GRα。健康人及哮喘患者的PBMC中,Dex预处理能显著抑制TNF-α诱导的IL-8分泌,而在COPD患者的PBMC中这种抑制作用不明显。结论COPD对糖皮质激素的不敏感与GRα核内转移有关。GRα核内转移受抑制可能是造成糖皮质激素在COPD患者中发挥抑制炎性作用欠佳的原因之一。

慢性阻塞性肺疾病;糖皮质激素;糖皮质激素受体;不敏感;核内转移

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种慢性非特异性炎性疾病。我国COPD的患病人数已超过4000万[1]。预计到2020年COPD病死率将上升到第3位,同时将成为世界第五大经济负担[2]。 在我国,轻中度(GOLDⅡ级)COPD患者的急性加重发生率为年均1.29次/人[3],轻中度患者的死亡率因为急性加重增加了2.78倍[4]。因此,在呼吸困难等症状出现前就应及时予以治疗,以预防疾病的不可逆性进展。

糖皮质激素(glucocorticoid,GC)已成为治疗哮喘的一线药物。但其对于轻中度COPD患者却缺乏疗效证据。体外实验也证实激素不能抑制COPD患者肺泡灌洗液中肺泡巨噬细胞释放促炎介质。目前COPD对激素治疗不敏感的机制尚不清楚。糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)表达减少,GC与GR结合减少,炎性通路的活性增强或辅阻遏物活性缺乏等因素都可导致对激素的不敏感,且这些因素受氧化应激等影响[5]。氧化应激反应减少GC-GR复合物核转移,阻断GC的抗炎性反应的同时,还降低了肺组织HDAC酶的活性,通过打破组蛋白乙酰化/脱乙酰化平衡,增加了促炎性基因的转录和翻译。氧化应激使轻中度COPD患者的炎性因子表达增加[6]。同时激活不同激酶途径,包括磷酸肌醇3激酶 (PI3K)/Akt途径。有研究表明COPD患者外周肺巨噬细胞中PI3Kδ和Akt的活性都升高,选择性地抑制PI3Kδ/Akt通路,可修复COPD患者激素抑制炎性介质表达的能力[7]。阻断COPD患者的巨噬细胞中的促炎因子MIF,GC不敏感好转,提示MIF在COPD中与GC不敏感有关[8]。

GC主要通过GR来实现作用。GRα作为GR的主要形式,一般以非活性复合体存在于细胞胞质中,当其与GC结合后,诱导热休克蛋白90 (HSP90)等分子伴侣的解离,促使GRα迅速转移至核中。继而与特异性DNA应答元件GC反应元件 (glucocorticoid response elements,GRE)结合,调节靶基因的转录[9-10],或者与其他转录因子如NF-κB、AP1发生蛋白质-蛋白质作用,通过调节下游基因的表达发挥GC的生物学效应。

在GC发挥抑制炎性的作用过程中,GR核内转移是一个关键步骤。本课题拟通过研究轻中度COPD及轻中度哮喘患者外周血单个核细胞(peripheral blood molecule cells,PBMCs)核内转移的GRα的表达变化,探讨GRα的核内转移及COPD患者对GC治疗不敏感的相关性。

资 料 和 方 法

试验对象正常对照组均来自志愿者,年龄为40～70岁,均无吸烟史,无呼吸系统疾病或过敏性疾病及遗传性激素反应缺陷的疾病。COPD组受试者来自复旦大学附属中山医院呼吸科门诊,其诊断标准和严重度分级标准参照2015 GOLD 指南 (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease),年龄为40～70岁。哮喘组受试者来自复旦大学附属中山医院呼吸科门诊,诊断及严重度分级标准符合2015 GINA 标准 (Global Initiative for Asthma),年龄为40～70岁。

所有受试对象最近一个月未服用抗惊厥药、红霉素和利福平等影响激素疗效的药物。受试者情况见表1。本研究内容经复旦大学附属中山医院医学伦理委员会批准 (B2014-108),受试者均被告知研究目的及试验程序,并签署知情同意书。

表1　COPD患者信息

Values are expressed median (interquartile range) in age,FEV1 (%pred) and FEV/FVC.FEV1:Forced expiratory volume in one second.FVC:Forced vital capacity.FeNO:Fractional exhaled nitric oxide (1 ppb=1×10-9mol/L).NA:Not available.

主要试剂和器材TNF-α,地塞米松 (dexamethasone,Dex) (美国Sigma 公司),IL-8 ELISA 试剂盒 (美国R&D 公司),抗GRα抗体 (美国Abcam公司),山羊抗兔二抗 (美国Santa Cruz公司),淋巴细胞分离液 (美国Sigma 公司),HBSS (美国Sigma 公司)。Leica TCS SP8 激光扫描共聚焦显微 (德国Leica 公司)。

标本采集 取受试者外周肘静脉血10 mL (10% EDTA抗凝),用PBS缓冲液按1∶1稀释并在50 mL无菌离心管中充分混匀。另一50 mL离心管加入淋巴细胞分离液12 mL,然后加入上述稀释血,20 ℃恒温水平300×g离心30 min后,吸取白色云雾层,置入另一无菌离心管中。向收集的细胞中加入10 mL的PBS缓冲液吹打混匀后,以1 800 r/min (r=10 cm,下同),20 ℃恒温水平离心10 min,以除去残余的分离液和杂质。弃取上清后,再用PBS缓冲液洗涤细胞2次,每次均以1 500 r/min,20 ℃恒温水平离心10 min。弃去上清,用PBS缓冲液重悬细胞。计算细胞活力及细胞计数。

对PBMCs的不同刺激处理 对各组PBMCs按浓度梯度分别加入含10-4～102μmol/L Dex及10%胎牛血清的1640培养液。培养4 h后,予各孔加入TNF-α 0.01 ng/mL,继续培养24 h。取上清,按照说明书采用ELISA检测PBMCs IL-8的表达。各组设3个副孔。各组PBMCs加入含1 μmol/L Dex及10%胎牛血清的1640培养液,按时间梯度分别培养1、2、4、6 h后提取细胞用于Western blot检测GRα表达。余下予各孔TNF-α 0.01 ng/mL,空白孔加入含10%胎牛血清的培养液,培养24 h后,取上清,按照说明书采用ELISA检测PBMCs IL-8的表达。各组加入含1 μmol/L Dex及10%胎牛血清的1640培养液,按时间梯度分别培养 0.5、1、2 h后,提取细胞,进行免疫荧光检测。

免疫荧光提取的细胞经4%多聚甲醛4 ℃固定10 min,待细胞固定后涂片。0.5%Trition 20 min孵育。PBS清洗标本3次,每次15 min。入血清 (与二抗来源一致)孵育20 min后,移入一抗:[兔抗-GRα (1:200)] 4 ℃过夜。次日,37 ℃复温,PBS清洗标本3次各15 min,入二抗孵育2 h。经PBS漂洗标本3次各15 min后,加入DAPI染液染30 min。PBS清洗标本3次各15 min。避光条件下50%甘油封片,共聚焦显微镜下观察,拍照。

Western blot检测 以细胞裂解液提取总蛋白,首先测定蛋白质浓度以保证蛋白质量相同。SDS-PAGE电泳后,65 V恒压电转蛋白至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭1h,滴加一抗 (1∶125)室温孵育1 h,4 ℃过夜,TBS缓冲液漂洗后加HRP二抗,室温孵育2 h后发光系统进行检测。表达相对定量采用Quantity One软件。

结　　　果

各组PBMCs中Dex对TNF-α诱导的IL-8动态抑制情况的比较为了从时序上了解Dex对PBMCs发挥抑炎作用的情况,对不同时间点Dex预处理的PBMCs给予TNF-α刺激,检测其对IL-8释放的抑制作用 (图1)。发现正常对照组对IL-8的抑制作用始终比较明显,在1、2、4、6h时IL-8分泌水平均较空白对照明显减少 (P<0.01)。在4h内哮喘患者均有抑制作用 (P<0.05),而COPD组的抑制炎性作用只维持了2h, (1hP <0.5,2hP<0.01)。组间比较也提示Dex对COPD患者的PBMCs的抑炎影响明显不及其对于健康人及哮喘患者的作用。

IL-8 concentration of PBMC from healthy volunteers,asthmatics and COPD patients cells were pre-incubated with Dex (1 μmol/L) for 1,2,4 and 6 hours prior TNF-α stimulation.Data was plotted as median±SEM.A:Healthy volunteer B:asthmatics C:COPD D:Comparison among three groups.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

图1TNF-α刺激Dex预处理的PBMCs时IL-8的变化

Fig 1Effects of TNF-α on IL-8 in the PBMCs pre-incubated with Dex

各组PBMCs中Dex对经TNF-α诱导的IL-8分泌的影响 为进一步确定各组PBMCs对激素的敏感性,将PBMCs过夜培养,各组基础IL-8水平无明显组间差异。PBMCs经TNF-α刺激致IL-8水平增加约8倍,但组间差异无统计学意义。然而,在COPD组的PBMCs中,Dex对TNF-α诱导的IL-8抑制曲线较正常对照组及哮喘组右移,即需更高的Dex半抑制浓度 (IC50dex)[中位数 (范围)为17.6 (8.6-39.7)nmol/L,n=15],与哮喘组[10.2 (7.2-32.3)nmol/L,n=15]和正常对照组[6.3 (3.4-17.3)nmol/L,n=12]相比,差异有统计学意义 (P<0.05,图2)。提示相较于轻中度哮喘患者和健康志愿者,COPD患者PBMCs对Dex相对不敏感。

各组PBMCs中Dex对总GRα动态变化的影响 为了解细胞内总GRα水平,我们从健康人、哮喘、COPD患者外周血中提取PBMC,给予Dex处理,分别于其后2、4、6h提取细胞,应用Western blot检测总GRα水平 (图3)。各组总GRα在Dex处理2 h后均有增加,且增幅明显大于核内GRα,提示Dex能明显增加胞质内GRα水平 (哮喘组、COPD组较空白对照明组明显增加P<0.05)。随后,总GRα水平变化出现明显差异。哮喘组及COPD组的总GRα水平随时间增加而减少,健康组PBMCs中的总GRα水平随时长的增加而增多 (6 h时P<0.05)。数据表明总GRα水平健康人与哮喘及COPD患者有明显差异,但是哮喘及COPD患者间无差异。

A:Dex (10-4-102μmol/L) was incubated 4 hours followed by 24 hours stimulation with TNF-α.ELISA was used to measure IL-8 levels in 12 healthy volunteers (HV),15 asthmatics,and 15 COPD patients.IC50Dex (50% inhibitory concentration) was measured and plotted in graph B.B:IC50Dex measured from A.was plotted for 12 healthy volunteers (HV),15 asthmatics,and 15 COPD patients.

图2地塞米松抑制PBMCs释放IL-8敏感性变化

Fig 2The variety of Dex sensitivity in inhibition of IL-8 releasing from PBMCs

Example of nuclear translocation as assessed by immunofluorescence of PBMCs treated with Dex (1 μmol/L) for 0.5 hour,1 hour and 2 hours.PBMCs were cytospined into slides and air dried.GRα was detected using an anti-GRα antibody with a secondary cy3-conjugated antibody (red).The nucleus was counter-stained using a cy5 To-Pro-3 (blue).A fixed area was drawn and used to measure the intensities of the red and blue channels in the nucleus.Ten cells per experiment were counted and the cy3 intensity used as the representation of nuclear GRα which was normalized for Dex treatment.Three patients′ pictures from confocal microscopy are shown.A:Healthy volunteers (Normal);B:Asthmatics;C:COPD patients.(1)vs.0 hour group,P<0.01.

图3Dex预处理PBMCs时GRα的变化

Fig 3Effects of Dex on GRα in the PBMCs

各组PBMCs中Dex对核内GRα动态变化的影响 由上述实验可知,在PBMCs中,经Dex处理后,哮喘和COPD患者总GRα蛋白质水平随时间改变的趋势相似。GR转移入核内是GC发挥抗炎抑炎作用的关键。为了解GRα在PBMCs中的具体分布,我们用免疫荧光法测定了核内GRα的荧光强度。分别检测各组受试者PBMCs在Dex处理0.5、1、2 h后核内GRα免疫荧光强度,结果发现3组PBMCs在未受Dex处理时,核内和胞质均有GRα分布,且以胞质为主。Dex处理0.5 h时,3组核内GRα均有一过性减少,可能与核内原有的GRα消耗有关。但此后,各组间核内GRα水平变化明显不同。健康人 (图4A)PBMC核内GRα的荧光强度随Dex处理时间增长而加强,在2 h处荧光强度增强有统计学意义 (P<0.05)。哮喘患者的PBMCs (图4B) Dex处理1h时核内GRα的荧光强度最强 (P<0.05),但随后其强度减弱。而COPD患者 (图4C)GRα的核内荧光强度,在Dex处理1 h时稍有增强,随后在2 h时明显减弱 (P<0.01)。数据提示,在健康受试者的PBMCs中,核内GRα的增加与Dex对GRα核内转移的影响有关,且这种影响持续增强。而在COPD患者PBMCs中,Dex对GRα核内转移的影响很微弱,且随时间的增长而减弱。结合Western blot结果,发现尽管在2 h时所有受试者的总GRα水平都增加了,但是在3组中核内GRα水平有明显差异,提示激素敏感性可能与GRα的核内转移有关。

PBMCs were incubated with Dex (1 μmol/L) for 1,2,4 and 6 hours.GRα was detected using immun of luorescent stainning.A:Healthy volunteers.B:Asthmatics;C:COPD patients;(1)vs.0 hour group,P<0.05.

图4Dex预处理PBMCs时GRα的核内转移的情况

Fig 4Effects of Dex on the translocation of GRα in the PBMCs

GRα核内转移与GC敏感性的相关性在各组PBMCs中,COPD组对激素相对不敏感,哮喘组相对敏感。而在GRα核内转移中,COPD组核内转移受抑制。为了解在PBMCs中Dex的敏感性与Dex影响下核内GRα水平的关系,我们通过共聚焦显微镜定位检测核内GRα荧光强度。IC50Dex来自前文结果。结果显示,Dex的半抑制率与GRα核内荧光强度呈明显负相关 (P=0.000 8,r=-0.54,图5),提示核内GRα水平的降低与Dex对细胞因子的抑制作用减弱相关,COPD的激素不敏感可能与GRα转移核内减弱有关。

讨　　　论

临床研究表明COPD患者对GC不敏感[14],而在体外的肺部细胞研究中也得到了同样的结果,如来自COPD患者的巨噬细胞已被研究者证实皮质醇激素不敏感[15]。近来发现Dex的抑制炎性作用在COPD患者的外周血中性粒细胞中要优于来源于COPD患者的痰液中的细胞[16],提示对于COPD患者来说,全身用药可能优于局部用药。全身性皮质类固醇激素在 COPD 治疗中的作用却仍存有争议。目前仍没有强力的证据来指导如何选择合适的患者、合理的用药方式及其恰当的疗程。有证据显示,当用于COPD急性加重期的治疗时,全身性GC可加快患者的康复,并减少其治疗失败[17],但仍没有证据证明其在轻中度COPD患者中的确切作用。本研究通过ELISA测试Dex抑制由TNF-α刺激的IL-8的半抑制浓度,证实COPD患者的PBMCs较健康人群及哮喘患者GC敏感性下降。本研究及相关文献提示,COPD患者中,GC抵抗不仅出现在肺部细胞,同时也出现在循环系统的细胞中,提示这种激素不敏感并非局部,而是累及全身的[18-19]。

Correlation between IC50Dex and the GRα nuclear translocation immunofluorescence intensity (IF) in all persons (n=35).

图5IC50 Dex与GRα核内转移的相关性

Fig 5Correlation between IC50Dex and the GRα nuclear translocation

IL-8是中性粒细胞的重要趋化因子,其细胞来源广泛,其中又以人PBMCs及内皮细胞最多[20]。有研究表明IL-8特异性结合中性粒细胞表面受体,致细胞变形反应,脱颗粒反应,释放溶酶体和形成超氧化物,从而促成炎性反应[21]。IL-8需在LPS (脂多糖)、TNF-α等诱导剂作用下合成释放。GC对IL-8基因转录的抑制是通过激素-受体复合物与IL-8基因5′末端的GC反应元件相互作用实现的。本研究发现相较于健康人、哮喘患者,Dex对COPD患者的IL-8抑制效果明显减弱 (图1),意味着问题可能出在激素-受体复合物上。

有研究表明,在人外周血白细胞中,Dex对GRα和β mRNA 水平均具有明显的下调作用[22],认为这种由配体诱发的受体水平下调是细胞的一种自我保护机制,可以降低靶细胞对激素的反应性,防止因激素的持续作用对细胞造成的损伤[23]。然而,我们通过Western blot检测总GRα蛋白质水平的结果却是3组受试者中总GRα水平至少在2 h内是增加的 (哮喘组和COPD组4、6 h减少)。有研究表明,地塞米松作用4～24 h,GRα的mRNA水平呈时间依赖性下降。而本研究发现,Dex处理2 h时GRα蛋白质水平增加。尽管结果上看似矛盾,但是从作用时长上来看,也许存在一个短期效果和长期效果的差别。当然,这其中的具体机制需要深入研究加以阐明。

GC需与其受体在胞质内结合,发生构象改变,形成GC-GR复合物,转移入核,作为转录因子激活或者抑制靶基因的转录来实现其生物学效应。不难看出,GR转移入核内是GC发挥抗炎抑炎作用的关键[11-13]。这一点在免疫荧光实验中得到证实,Dex处理2 h时,COPD患者的PBMCs中的核内GRα明显较哮喘患者或健康受试者少。在免疫荧光动态观察Dex对核内GRα水平的影响过程中,我们发现,未受Dex处理时,GRα在胞质胞核都有分布,Dex作用30 min,3组受试者的PBMCs中的核内GRα均减少,可能与核内原有GRα的消耗有关。在1 h时3组核内GRα均有增加,提示GRα的入核开始起作用。有研究发现在轻中度哮喘患者及健康人痰液中的上皮细胞和巨噬细胞[24],哮喘患者及鼻息肉患者的成纤维细胞[25],激素受体入核发生在Dex处理30 min时,被称为快速入核。故此,提示地塞米松促进GRα入核。至于试验显示核内GRα在地塞米松处理1h开始有增多的结果与30 min快速入核的已有结论有出入,推测与核内GRα消耗速度快于入核速度有关,而这种消耗有实验表明与蛋白酶体途径有关[26]。因此,GRα的入核是一个动态的过程,与GRα的核内消耗存在一定程度上的平衡。所以在3组中1 h时GRα的入核多于其核内消耗的GRα,表现为核内GRα的荧光强度较前增加;其后的2 h,健康受试者核内GRα的荧光强度继续增加,而哮喘患者的相对减少,COPD患者的明显减少。在预实验中我们同时也检测了Dex处理4 h及6 h的各组荧光强度,发现2 h后这种趋势趋于稳定,所以本研究选择了2 h内的处理时间。这种趋势提示,Dex在激素敏感的健康人及相对敏感的哮喘患者中的作用时长较激素不敏感的COPD要长。而Western blot试验显示3个试验组的总GRα在地塞米松处理2 h内均升高,提示总GRα并不是影响核转移的主要因素,COPD患者GRα在地塞米松处理2 h时减少可能与核内转移受抑制和/或核内GRα降解增加有关。而核内转移受抑制和/或核内GRα降解增加可能是COPD患者GC耐受的一个原因[27]。

本研究证实了在COPD患者的PBMCs中存在激素耐受。GRα的核内转移与GC的敏感性呈正相关。发现在COPD患者的PBMCs中,核内GRα水平是一个动态的过程,Dex对其作用的减弱可能与GRα的核内转运受抑制和/或核内GRα降解增加有关。本研究为阐明COPD患者GRα的核内转运受抑制机制及COPD激素耐受研究提供了新的思路。

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sE-mail:czh60@hotmail.com;wang.xiangdong@zs-hospital.sh.cn

Correlation between glucocorticoid insensitivity of chronic obstructive pulmonary disease and glucocorticoid receptor nuclear translocation

SUN Xiao-ru1,2, DONG Nian1, YUAN Hong-lei1, SU Xiao-qiong1, WANG Xiang-dong3△, CHEN Zhi-hong1△

(1DepartmentofRespiration,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2DepartmentofInfectiousDiseases,theSecondAffiliatedHospital,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310009,ZhejiangProvince,China;3BiomedicalResearchCenter,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

ObjectiveTo confirm whether the poor response to glucocorticoids (GCs) in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is due to impairmnt of the GC receptor (GRα) nucleus translocation.MethodsPeripheral blood molecule cells (PBMCs) from samples of 10 healthy controls and 15 patients with COPD and 15 asthmatics were culturedinvitro.Corticosteroid sensitivity was detected by measuring dexamethasone inhibition of TNF-α induced IL-8 production in PBMCs by using ELISA.PBMCs were incubated with budesonide or 1 μmol/L dexamethasone (Dex) for different times (30 min to 6 h) and GRα translocation was analyzed by immunofluorescence and

chronic obstructive pulmonary disease;glucocorticoid;glucocorticoid receptor;insensitivity;nucleus translocation

R56

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.04.007

2016-01-31;编辑:张秀峰)

国家自然科学基金(81270078,81470211)

confocalmicroscopy.ResultsPBMCs from COPD patients were relatively less sensitive to Dex as compared with those of non-severe asthmatics and healthy volunteers.The IC50values of Dex negatively correlated with decreased GR nuclear translocation assessed using immunocytochemistry (r=-0.54;P=0.0008).Dex increased the protein level of GRα in every group,whereas the distribution of GRα in the cell was different among the groups.We found that Dex significantly induced GRα translocation in controls and asthmatics compared with baseline.There was a decrease of GRα translocation compared with baseline in the PBMCs derived from the patients with COPD (2 h,P<0.05).Pretreatment with Dex effectively inhibited TNF-α-induced IL-8 production in control and asthma groups,but the effect was not that significant in the COPD group.ConclusionsOur data indicate that the insensitivity to GC treatment in COPD patients may due to GRα nucleus translocation impairment.The GR translocation inhibition may be one reason for the GCs reduced anti-inflammation activity in COPD patients.

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81270078,81470211).