人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2的表达与纯化

李娟娟　李　洋　杨　青,2△

(1复旦大学生命科学学院生物化学系　上海　200438; 2 云南天然产物与生物制药协同创新中心　昆明　650091)



人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2的表达与纯化

李娟娟1李洋1杨青1,2△

(1复旦大学生命科学学院生物化学系上海200438;2云南天然产物与生物制药协同创新中心昆明650091)

目的构建人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2 (human indoleamine 2,3-dioxygenase-2,hIDO2)原核表达载体,表达、纯化获得hIDO2蛋白。方法采用基因工程手段获得hIDO2原核表达载体并转化表达菌株,筛选合适的重组质粒及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)浓度进行蛋白表达;通过亲和层析纯化重组hIDO2,BCA法测定蛋白浓度并计算蛋白收率;SDS-PAGE电泳检测hIDO2表达情况,通过软件分析得到蛋白纯度;Western blot检测目的蛋白特异性。结果重组质粒经电泳分析、双酶切、DNA测序鉴定表明构建成功;经筛选发现重组质粒pET28a-hIDO2比pGEX-4T-1-hIDO2的hIDO2表达效果好;SDS-PAGE电泳及Western blot均验证了在相对分子质量45 000处的特异性目的条带的存在;经测定及计算得出蛋白纯度为97.1%,蛋白浓度为20 mg/mL,蛋白收率为15 mg/L。结论成功构建重组质粒用于表达及纯化hIDO2,蛋白浓度、纯度、收率及特异性均较高。

吲哚胺2,3-双加氧酶-2;人源;蛋白表达;蛋白纯化

吲哚胺2,3-双加氧酶-2 (indoleamine 2,3-dioxygenase-2,IDO2),是继吲哚胺2,3-双加氧酶-1 (indoleamine 2,3-dioxygenase-1,IDO1)、色氨酸双加氧酶 (tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)之后,第3个被发现能够催化色氨酸沿着犬尿氨酸途径 (kynurenine pathway,KP) 代谢的限速酶,可催化色氨酸分解产生L-犬尿氨酸、喹啉酸等多种具有生物活性的代谢产物[1]。其中TDO主要存在于肝脏中,受糖皮质激素及L-色氨酸的诱导[2],尚未发现其免疫调节活性[3];IDO1 广泛分布于除肝脏以外的其他组织中,是细胞内的一种含亚铁血红素的单体蛋白质,1967年首次在兔肠道细胞中被发现[4]。作为IDO1的类似蛋白,IDO2 (EC 1.13.11.52)于2007年首次被发现[5-8]。

研究表明,IDO1过度活化与抑郁症[9]、阿尔茨海默病[10-11]、白内障、癌症等人类重大疾病密切相关[12-13]。在机制方面,IDO1可以通过介导T细胞凋亡或Tregs形成从而引起肿瘤免疫逃逸[14-15]。Qian等[16]研究发现,IDO2也可以抑制人类T淋巴细胞的增殖。由IDO1所引起的对T细胞增殖的抑制作用可以由提高色氨酸浓度或加入其抑制剂1-甲基色氨酸 (1-methyl-tryptophan,1-MT)而逆转,与IDO1明显不同的是,由IDO2引起的T细胞增殖的抑制作用即使补充高浓度色氨酸或1-MT也不能逆转。这一现象说明,在抑制T细胞增殖的反应中IDO2与 IDO1可能存在不同的信号调节通路,并且二者发挥不同的免疫调节作用。Metz等[17]研究发现在IDO2基因敲除小鼠 (IDO2-/-mice)体内,依赖IDO1的Tregs产生量明显减少,表明IDO2对于IDO1介导的T细胞增殖的抑制或炎性反应是必要的,进一步说明IDO2在免疫过程中十分重要。关于抑制IDO1还是IDO2具有更好的抗肿瘤效果,Hou等[18]曾在黑色素瘤的研究中发现用D-1-MT抑制IDO2并与环磷酰胺联用可以显著减小肿瘤,比L-1-MT抑制IDO1引起的抑瘤效果更好,不过之后未见类似的报道。以上研究表明,IDO2与IDO1关系密切,两者可能共同作用参与肿瘤发生、肿瘤免疫耐受、炎性反应等重大疾病或生理活动,因此IDO2有望成为IDO1以外又一重要的药物发现靶标。

IDO1在肿瘤的免疫耐受、基因表达、信号转导中的重要作用已被人们所认识。IDO1抑制剂因在IDO1介导的具有色氨酸代谢病理学特征的疾病(包括癌症、艾滋病、阿尔茨海默病、抑郁症、白内障等)的治疗中具有潜能而成为研究热点。与被广泛研究的IDO1相比,人们对IDO2的生理生化、免疫等方面的功能了解甚少,究其原因主要是IDO2的表达纯化、结构解析等方面的研究有限,IDO2尚未商品化,IDO2活性检测系统建立、IDO2抑制剂筛选及应用等工作尚未广泛开展。

目前国内尚无人源IDO2 (human IDO2,hIDO2)蛋白在细菌中表达、纯化的相关报道,本研究首次采用基因工程手段构建hIDO2原核表达载体,通过比较目的蛋白表达情况,筛选出适用于人源IDO2表达的重组质粒及合适的IPTG诱导浓度,通过亲和层析纯化获得高浓度、高纯度、高收率、高特异性的hIDO2蛋白,为IDO2大规模表达奠定基础。

材 料 和 方 法

药品与试剂 人源IDO2 cDNA (上海吉玛制药技术有限公司);异丙基-β-D硫代半乳糖苷 (isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG,美国Sigma-Aldrich公司);5-氨基乙酰丙酸盐酸盐 (5-ALA,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);限制性内切酶(日本TaKaRa公司)、PrimeSTAR Max DNA聚合酶 (日本TaKaRa公司);NovoRec重组酶(上海近岸科技有限公司);BL21 DE3/DH5α菌株 (Biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心);凝血酶 (美国Sigma-Aldrich公司);人源IDO2一抗(美国Santa Cruz Biotechnology公司);HRP标记二抗、ECL显色液、BCA法蛋白浓度测定试剂盒 (上海碧云天生物技术有限公司)。

仪器与设备 Legend Micro 17R高速离心机(美国Thermo Fisher公司);转膜仪、S1000TMPCR仪(美国BioRad公司);SW-CJ-1FD 洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);SCS-24恒温摇床(江苏太仓实验设备厂);低温超高压连续流细胞破碎机(广州聚能纳米生物科技股份有限公司);垂直平板电泳仪(北京百晶生物技术有限公司);Hi 6FF蛋白纯化镍柱(上海楚知生物科技有限公司);GST预装蛋白纯化柱(上海生工生物工程有限公司);10 000蛋白超滤管(美国Millipore公司);Sephadex G-25脱盐柱(美国GE公司);DNP型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司);Clinx ChemiScope (上海勤翔科学仪器有限公司);Multiskan MK3酶标仪、超低温冰箱(美国Thermo Fisher公司);

重组质粒pGEX-4T-1-hIDO2的构建 构建重组质粒pGEX-4T-1-hIDO2,使用全长1 263 bp hIDO2目的基因,根据NovoRec重组酶技术操作手册设计相应的PCR引物,该引物包括5′端不少于15bp与载体同源的序列以及20～25 bp的目的基因片段,经过PCR扩增可使得目的片段两端均有不少于15 bp的序列与线性化载体的序列一致。重组质粒pGEX-4T-1-hIDO2表达的融合蛋白含有GST-tag。具体引物序列及酶切位点信息见表1。

表1　pGEX-4T-1-hIDO2引物序列及酶切位点

Endonuclease sites are emphasized with linear underline;pGEX-4T-1-hIDO2 is digested withSalI andNotI.

以全长hIDO2的cDNA为PCR模板,利用PrimeSTAR Max DNA聚合酶进行PCR反应获得目的片段,反应条件为:98 ℃预变性3 min,98 ℃、10 s,58 ℃、12 s,72 ℃、1.5 min,30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,利用胶回收试剂盒回收扩增片段。然后用SalI、NotI双酶切载体质粒pGEX-4T-1,并回收线性化片段。

将回收后的目的DNA与线性化pGEX-4T-1按照 3∶1～10∶1的摩尔比加入到PCR管中,根据操作说明加入适量NovoRec重组酶及相应Buffer,混合液于37 ℃水浴20 min。反应结束后立即将重组反应液转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞中并冰浴30 min,然后在42 ℃恒温水浴中热激90 s,冰浴3 min,超净工作条件下将转化液均匀涂抹在含50 μg/mL氨苄抗生素 (Amp) 的培养板上,37 ℃恒温培养箱中倒置培养16 h,第2天从选择性培养板上挑取单克隆在含50 μg/mL氨苄抗生素 (Kan)的LB培养基中扩增,当菌液D600>1.0之后抽提质粒,进行电泳鉴定,并将初步鉴定正确的阳性克隆送至上海华津生物科技有限公司测序,经测序确认构建成功,可用于下一步蛋白表达。

融合蛋白GST-hIDO2的表达及纯化用测序正确的pGEX-4T-1-hIDO2转化大肠埃希菌表达菌株BL21 DE3,并接种到适量氨苄霉素抗性 (终浓度50 μg/mL)的LB中,37 ℃、220 r/min培养16 h;第2天按1:50的比例将上述培养物接种在1 L新的LB培养基中扩大培养,温度及摇床转速不变,当菌液D600达到 0.6 时将培养温度降至室温并加入0.5 mmol/L的5-ALA及终浓度0.2 mmol/L的IPTG,室温、150 r/min诱导16 h。诱导结束后4 ℃,5 400×g离心15 min,收集菌体,-80 ℃深冷冰箱冻存或用于下一步蛋白纯化实验。

用适量预冷25 mmol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH=7.5,含1 mmol/L PMSF,150 mmol/L NaCl,10 mmol/L咪唑)均匀重悬菌体,低温高压条件下进行菌体破碎:将重悬的菌液匀浆倒入预冷Tris-HCl冲洗过的细胞破碎仪,仪器利用超高压能量使样品通过狭缝瞬间释放,在剪切效应、空穴效应、碰撞效应的作用下,使菌体细胞破碎、均质、乳化。由于进样、破碎、出样全过程都在-4 ℃低温循环水浴中进行,有利于保持原有物质活性和性能。为达到较理想的效果可将菌液反复进样破碎3次,所有操作按说明书指示进行。破碎后收集该匀质液于4 ℃、13 800×g 条件下离心40 min,弃沉淀取上清,然后将上清流经已用4 ℃预冷保存的结合缓冲液(上海生工生物工程有限公司,pH=7.4)平衡的GST预装柱;重组质粒pGEX-4T-1-hIDO2表达的融合蛋白由于含有GST-tag,因此会特异性结合到柱料上,而杂蛋白则不能结合。用预冷的洗涤缓冲液(上海生工生物工程有限公司,pH=7.4)洗脱下杂蛋白,最后用预冷的洗脱缓冲液(上海生工生物工程有限公司,pH=8.0)洗脱下融合蛋白GST-hIDO2。

GST-hIDO2蛋白的酶切处理 由于融合蛋白GST-hIDO2带有较大GST-tag (相对分子质量约26 000),可能会对后续其他实验如酶活性测定、特异性抑制剂筛选或蛋白结晶等产生不良影响,用特异性酶将其切除,具体操作如下:

收集从GST柱上洗脱下来的融合蛋白,向其中加入适量凝血酶,充分混匀,4 ℃酶切约12 h;将酶切后的蛋白再次重新挂柱 (GST-tag可以特异性结合到柱料上,而切去了标签的hIDO2则不能结合),收集柱流出液即可得到不带GST-tag标签的IDO2,最后用预冷的洗脱缓冲液洗脱标签蛋白;取适量蛋白与等体积2×蛋白加样缓冲液混匀,100 ℃干浴15 min,SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝 (G-250)染色,观察融合蛋白酶切情况。

重组质粒pET28a-hIDO2的构建 构建重组质粒pET28a-hIDO2,使用的也是全长1 263 bp的hIDO2,利用NovoRec同源重组技术操作手册设计相应引物。具体引物序列及酶切位点信息见表2。

表2　pET28a-hIDO2引物序列及酶切位点

Endonuclease sites are emphasized with linear underline;pET28a-hIDO2 is digested withNdeI andXhoI.

以上述hIDO2 cDNA为PCR模板,进行高保真PCR反应,反应条件为:98 ℃预变性3min;98 ℃变性10s,56 ℃复性12s,72 ℃退火3min,28个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分析,并利用胶回收试剂盒回收目的片段。限制性内切酶NdeI、XhoI双酶切质粒pET28a,回收线性化载体片段。

DNA同源重组连接及DH5α感受态细胞的转化同pGEX-4T-1-hIDO2载体构建的操作步骤,然后将转化液均匀涂布在具有卡那霉素抗性的选择性培养板上,37 ℃恒温箱中倒置培养16 h,次日挑取单克隆在含相应抗生素的LB培养基中扩增。提取重组质粒进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳分析,将初步鉴定出的阳性克隆送至专业的公司测序。

IPTG浓度筛选用测序正确的pET28a-hIDO2转化大肠埃希菌表达菌株BL21 DE3,并接种到适量卡那霉素抗性 (终浓度50 μg/mL)的LB中,37 ℃、220 r/min培养16 h;第2天按1:50的比例将过夜培养物接种在适量新的LB培养基中扩大培养,温度及摇床转速不变,当菌液D600达到0.6时将培养温度降至室温并加入0.5 mmol/L的5-ALA及不同终浓度的IPTG,室温、150 r/min诱导表达16 h。诱导结束后取等量pET28a-hIDO2转化菌 (未加IPTG诱导组及不同终浓度IPTG诱导组)分别加入2×加样缓冲液,100 ℃干浴15 min,SDS-PAGE电泳结束后用考马斯亮蓝染液 (G-250)染色,脱色检测,观察不同重组质粒转化菌目的蛋白表达情况。

重组hIDO2的表达与纯化用测序正确的pET28a-hIDO2转化大肠埃希菌表达菌株BL21 DE3并接种到适量50 μg/mL Kan的LB中,37 ℃、220 r/min过夜培养;第2天按1∶50的比例将过夜培养物接种在1 L新的LB培养基中扩大培养,温度及摇床转速不变,当菌液D600达到0.6 时将培养温度降至室温并加入0.5 mmol/L的5-ALA及终浓度0.05 mmol/L的IPTG,室温诱导目的蛋白表达。诱导结束后4 ℃,5 400×g离心15 min,收集菌体,-80 ℃深冷冰箱冻存或直接用于下一步蛋白纯化实验。

用适量预冷的25 mmol/L Tris-HCl 缓冲液均匀重悬菌体,低温高压条件下进行菌体破碎,实验操作步骤同GST-hIDO2纯化。破碎结束后4 ℃、13 800×g离心40 min,收集上清,然后将上清流经已用4 ℃预冷的PBS平衡的Ni-NTA预装柱;重组质粒pET28a-hIDO2表达的融合蛋白由于含有6个组氨酸构成的his-tag,因此会特异性结合到柱料上,而杂蛋白则不能结合。用预冷的含40 mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱非特异结合的杂蛋白,再用含250 mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱下目的蛋白。4 ℃条件下,将得到的hIDO2用10 000超滤管进行蛋白浓缩,再利用Sephadex G-25脱盐柱将蛋白缓冲液置换为50 mmol/L的磷酸盐缓冲液 (pH=7.5),得到纯化的hIDO2蛋白。SDS-PAGE电泳检测,考马斯亮蓝染液 (R-250)染色、脱色检测,并用Bandscan 5.0凝胶图像分析软件分析目的条带纯度。

BCA法测重组hIDO2蛋白浓度根据BCA法蛋白浓度测定试剂盒的技术手册进行操作:首先取蛋白标准配制液0.5 mL加入到蛋白标品BSA中,得到25 mg/mL的蛋白标准液,然后等比稀释得到25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25、0.390 625、0.195 312 5 mg/mL共8个浓度;根据样品数量,按50∶1的体积比将BCA试剂A与BCA试剂B充分混匀,得到适量BCA工作液;取一个96孔酶标板,各孔分别加入200 μL BCA工作液,然后按4 μL/孔分别加入蛋白标准液或者适当稀释的待测蛋白hIDO2,用移液器轻轻吹打混匀或者放在酶标仪上震荡30 s。37 ℃静置30 min后取出酶标板,用酶标仪在波长562 nm下读取每孔的吸光度值(D)。以蛋白浓度 (mg/mL)为横坐标,D为纵坐标,绘制蛋白标准曲线;根据所测样品的D值及标准曲线上的公式计算得到相应的蛋白浓度 (mg/mL)。

重组hIDO2蛋白Western blot鉴定取1 μL纯化后的hIDO2蛋白稀释50倍,然后取适量与2×加样缓冲液于Eppendorf 管中混匀,100 ℃干浴后取等量hIDO2及蛋白Marker上样,SDS-PAGE电泳结束后利用转膜仪将凝胶中的蛋白转印到PVDF膜上,5% (w/v,PBS配制)的脱脂牛奶常温封闭2 h。加入适量人IDO2一抗 (兔源,1∶200稀释)4 ℃孵育过夜,PBST (含0.3% Tween-20的PBS溶液)溶液洗膜 (每次10 min,洗3次)后再加入相应的二抗 (山羊抗兔,1∶2 000),室温震荡孵育1 h,PBST再次洗膜后用ECL化学发光试剂盒在Clinx ChemiScope仪器中显色。

结　　　果

重组质粒pGEX-4T-1-hIDO2的构建挑取pGEX-4T-1-hIDO2转化的DH5α单克隆大量扩增抽提重组质粒,以环状空质粒pGEX-4T-1为阴性对照 (control),1%琼脂糖凝胶电泳分析。由于重组质粒含有1 263 bp的目的基因,因此其相对分子质量会比空质粒的大,电泳过程中迁移的速度慢,据此原理可以粗略判断重组质粒构建情况 (图1)。然后将初步鉴定出的阳性克隆送专业公司测序,测序结果经比对软件分析,重组质粒中的基因序列完全正确,表明上述重组质粒构建成功。

Control:pGEX-4T-1;Lane 1-4:Extracted pGEX-4T-1-hIDO2.

图1pGEX-4T-1-hIDO2质粒电泳验证

Fig 1Electrophoresis identification of pGEX-4T-1-hIDO2

融合蛋白GST-hIDO2的表达、纯化及酶切处理 取等量未加IPTG诱导菌体总蛋白、0.2 mmol/L IPTG诱导菌体总蛋白、GST柱流出液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液分别上样进行SDA-PAGE电泳检测,从结果可以看出IPTG诱导组菌体总蛋白及洗脱缓冲液的泳道在相对分子质量70 000左右处均有特异性融合蛋白GST-hIDO2条带 (相对分子质量大小包括约26 000的GST标签蛋白及约45 000的hIDO2),而未诱导组及其他杂蛋白组的泳道则没有该目的蛋白条带 (图2,泳道1～5),表明融合蛋白表达成功;但是也存在一些问题,从泳道5可以看出从亲和层析柱上洗脱的蛋白中不仅含有融合蛋白,还含有一定量的GST标签蛋白,对蛋白纯度造成一定影响。

M:Protein marker;Lane 1:The total protein before induction;Lane 2:The total protein after induction with 0.2 mmol/L IPTG;Lane 3:GST resin flow-through fraction;Lane 4:Protein eluted by washing buffer (pH=7.4);Lane 5:Protein eluted by elution buffer (pH=8.0);Lane 6:HIDO2 after thrombin digestion;Lane 7:GST-tag after thrombin digestion.

图2GST-hIDO2蛋白纯化及其酶切处理结果

Fig 2Purification and thrombin digestion of GST-hIDO2

由于融合蛋白带有相对分子质量较大的GST标签,对后续hIDO2酶活性测定、hIDO2抑制剂筛选等实验可能会产生不良影响,因此我们用凝血酶对GST-hIDO2进行了酶切处理。酶切结果如图2所示,从泳道6-7我们可以看出标签蛋白切除效果不太理想2,GST-tag没有切完全,造成得到的目的蛋白hIDO2有较大损失;延长酶切时间及改变酶切温度重复实验也没有明显改善。综合蛋白纯度及酶切后蛋白浓度考虑,后续实验中没有再使用pGEX-4T-1-hIDO2这一重组质粒。

重组质粒pET28a-hIDO2的构建从转化的DH5α扩增菌中提取重组质粒,然后用NdeI、XhoI双酶切重组质粒pET28a-hIDO2,酶切产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测 (图3,泳道2)。发现在1 200 bp左右出现特异性DNA条带大小与预测一致。测序结果显示重组质粒中的基因序列完全正确,酶切及测序结果表明该重组质粒构建成功。

Lane 1:DNA Marker;Lane 2:pET28a-hIDO2.

图3重组质粒pET28a-hIDO2的酶切验证

Fig 3Identification of pET28a-hIDO2 by restriction endonuclease digestion

IPTG浓度筛选比较图4泳道2、3、4可以看出,与未加IPT诱导组 (泳道2)相比,重组质粒pET28a-hIDO2转化的表达菌株在0.05及0.1 mmol/L两个浓度的IPTG诱导下 (分别为泳道3和4)均有hIDO2的表达,且IPTG浓度为0.05 mmol/L时目的蛋白表达量更高,即该浓度的IPTG hIDO2诱导表达效果更好,因此下一步实验中hIDO2的扩大表达均用该浓度的IPTG。

重组hIDO2的表达与纯化pET28a-hIDO2转化BL21 DE3菌株诱导表达,将菌体破碎的上清流经Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化,SDS-PAGE电泳检测结果见图5 A。由图看出,与未诱导组相比,0.05 mmol/L IPTG诱导后,菌体总蛋白、250 mmol/L咪唑洗脱液在相对分子质量约45 000处可见到特异的目的蛋白条带,而未诱导组菌体总蛋白、40 mmol/L咪唑洗脱液则无此特异条带,表明hIDO2表达成功。利用凝胶图像分析软件Bandscan 5.0分析泳道5,目的条带hIDO2的灰度与该泳道所有蛋白条带灰度的比值即为hIDO2的纯度,通过软件计算得出hIDO2纯度达到了97.1%,纯度非常高。

Lane 1:Protein marker;Lane 2:The total protein without induction;Lane 3:The total protein after induction with 0.05 mmol/L IPTG;Lane 4:The total protein after induction with 0.1 mmol/L IPTG.

图4不同浓度IPTG hIDO2诱导表达效果筛选

Fig 4Identification of hIDO2 expression induced by different IPTG concentrations

重组hIDO2蛋白Western blot鉴定由图5 B看出,与阴性对照(未诱导组菌体总蛋白)相比,上样纯化后的hIDO2的泳道在相对分子质量45 000处有非常明显的蛋白条带,且无任何杂条带,表明纯化后的hIDO2特异性很强。

BCA法测重组hIDO2蛋白浓度根据BCA浓度测定试剂盒的说明书进行操作,以蛋白标品浓度对每个浓度的D562值绘制蛋白标准曲线,趋势线的R2>0.999,表明标曲线性较好。将待测hIDO2的D值带入标准曲线上的公式,计算得到蛋白浓度为20 mg/mL。再利用获得目的蛋白的总量与总诱导表达菌量的比值计算出hIDO2的收率为15 mg/L,蛋白浓度及收率均达到较高水平。经计算,本实验纯化的hIDO2比活力为69.4 μmol·h-1·mg-1。

A:Lane 1,protein marker;Lane 2,the total protein before induction;Lane 3,the total protein after induction with 0.05 mmol/L IPTG;Lane 4,protein eluted at 40 mmol/L imidazole;Lane 5,protein eluted at 250 mmol/L imidazole;B:Western blot of hIDO2.

图5hIDO2纯化过程中SDS-PAGE检测及Western blot鉴定结果

Fig 5SDS-PAGE analysis and Western blot of hIDO2 purification

讨　　　论

作为催化色氨酸沿犬尿氨酸途径分解代谢的关键限速酶,IDO1广泛分布于人和动物的多种组织和细胞中[19];机体在正常状态下呈低水平表达,但在某些特殊或病理状态下 (如妊娠、器官移植、慢性感染以及肿瘤等)其表达水平会显著上升,主要通过引起局部微环境色氨酸耗竭及生成神经毒性代谢产物等机制[20],直接或间接对T细胞、神经细胞产生影响,参与介导局部的免疫抑制反应[9,21],并与神经系统疾病 (如阿尔兹海默症、抑郁症等)也有着非常密切的联系,引起了人们的广泛关注。鉴于IDO1在免疫调控和多种人类重大疾病发生过程中不可替代的作用,IDO1已成为上述疾病治疗的重要靶标[22],IDO1抑制剂作为极具开发前景的药物也吸引了众多研究者和制药工作者的目光[23-24]。

与IDO1相比,IDO2蛋白的分布范围相对局限,小鼠体内表达IDO2蛋白最丰富的器官是肾,其次是副睾、肝脏;在某些组织中IDO1和IDO2均有表达,但是却定位于不同的细胞中,例如在肾脏中,IDO1的表达主要定位于肾血管而IDO2却只表达于肾小管[1]。尽管与IDO1在表达分布、底物亲和性、酶活性高低、pH等方面具有一定差异,但IDO2与IDO1在功能上是保守的,即IDO2也是催化色氨酸降解的限速酶之一,IDO2参与了多种生理和病理的免疫调节[16-17]。

本研究采用基因工程手段构建了2个hIDO2原核表达载体pGEX-4T-1-hIDO2和pET28a-hIDO2,并通过比较目的蛋白表达情况筛选出hIDO2表达效果较好的重组质粒及IPTG浓度;通过亲和层析方法获得了纯化的hIDO2,经测定及计算得出蛋白纯度为97.1%,蛋白浓度为20 mg/mL,蛋白收率为15 mg/L。SDA-PAGE电泳检测及Western blot分析均发现在相对分子质量约45 000处有特异性目的条带。综上所述,本实验成功获得了高浓度、高纯度、高收率、高特异性的hIDO2蛋白,所用质粒载体、菌株均为一般实验室常用易得的原材料,方法简单易行,为IDO2大规模表达奠定基础。通过这一方法获得的IDO2蛋白可以广泛用于研究其体内酶活性、特异性抑制剂筛选、蛋白结晶,也为进一步探寻IDO2的正常生理功能、参与疾病发生的机制等重要课题提供非常有价值的研究对象。

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E-mail:yangqing68@fudan.edu.cn

Expression and purification of human indoleamine 2,3-dioxygenase-2

LI Juan-juan1,LI Yang1,YANG Qing1,2 △

(1DepartmentofBiochemistry,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China;2theCollaborativeInnovationCenterofYunnanNaturalProductsandBiologicalPharmacy,Kunming650091,YunnanProvince,China)

ObjectiveTo construct human indoleamine 2,3-dioxygenase-2 (hIDO2) prokaryotic expression vectors to express and obtain purified hIDO2.MethodsUsing genetic engineering method to obtain hIDO2 prokaryotic expression vectors and transformEscherichiacoliexpression strains among which an optimal recombinant plasmid and isopropy-β-D-thiogalactoside (IPTG) concentration were screened and used for massive hIDO2 expressing.Affinity chromatography was used for hIDO2 purification.BCA method was used for protein concentration and yield measurement,SDS-PAGE electrophoresis was used for hIDO2 expression quantity determination and the purity was calculated with relevant software.Western blot was used for specificity detection.ResultsElectrophoretic analysis,double restriction endonuclease digestion and sequencing confirmed the successful construction of hIDO2 expression vectors.pET28a-hIDO2 was found to be a better recombinant plasmid to express human IDO2 than pGEX-4T-1-hIDO2.A specific target stripe at molecular weight (Mr) of about 45 000,same as predicted,was observed in both SDS-PAGE electrophoresis and Western blot.The purity,concentration and yield of hIDO2 was 97.1%,20 mg/mL

indoleamine 2,3-dioxygenase-2;human;protein expression;protein purification

Q331,Q786

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.04.004

2016-03-26;编辑:王蔚)

国家自然科学基金 (81373396,81573310);高等学校博士学科点专项科研基金 (20130071110037)

and 15 mg/L,respectively.ConclusionsWe successfully constructed recombinant plasmids using which we expressed and purified hIDO2 with high concentration,purity and yield.

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81373396,81573310) and the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China (20130071110037).