脑心通对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织细胞内Ca2+的影响

杜培坤，李妍怡，王艳玲，金 红

（安阳钢铁公司职工总医院神经内科，河南　安阳　455000）

脑心通对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织细胞内Ca2+的影响

杜培坤，李妍怡，王艳玲，金 红

（安阳钢铁公司职工总医院神经内科，河南安阳455000）

目的 探讨脑心通对缺血再灌注导致神经细胞损伤的保护机制。方法 采用反复夹闭双侧颈总动脉结合鼠尾放血引起循环血量减少的方法制备拟脑缺血再灌注损伤大鼠模型，观察大鼠脑组织细胞内Ca2+含量，并做海马区HE染色，观察海马组织的病理改变。结果 脑海马细胞内Ca2+含量明显降低。结论 脑心通可以减少脑缺血再灌注损伤后细胞外Ca2+进入细胞内，从而可以防止细胞内Ca2+超载损伤，保护脑组织及神经细胞。

脑心通；缺血再灌注；Ca2+

急性缺血性脑血管病是危害人类健康的常见病和多发病之一，具有较高的致死率、致残率及复发率，中医药对脑血管病的治疗越来越受到关注，尤其中药复方制剂可以通过多环节、多途径、多靶点作用于脑缺血各环节，其中脑心通胶囊是由黄芪、丹参、桃仁、红花、地龙等中药组成的复方制剂，多项研究表明，脑心通胶囊治疗气虚血瘀、脉络闭阻导致的中风临床疗效确切，是临床防治缺血性脑卒中的有效药物［1］。为探讨其治疗急性缺血性脑血管病的部分作用机制，本实验用反复夹闭双侧颈总动脉结合鼠尾放血的方法制备拟脑缺血再灌注损伤大鼠模型，观察大鼠脑组织细胞内Ca2+含量变化及海马组织的病理改变进行研究。

1　材料与方法

1.1材料

选用4月龄无特定病原体（SPF）级SD大鼠50只，步长脑心通胶囊，细胞内钙离子测试剂，流式细胞仪。

1.2实验方法

1.2.1动物分组

选取SD大鼠50只，雌雄各半，随机分为空白组10只和假手术组10只，余30只造模。然后再采用卒中指数评分标准选取20只造模成功的大鼠，随机分为模型组10只、步长脑心通组10只。

1.2.2模型制备

采用由Nordtrom建立的2VO阻断缺血模型，加鼠尾放血改良后用于本实验模型制备［3］。要求术前禁食水。用水合氯醛腹腔内注射麻醉大鼠，仰卧固定，被皮，常规消毒，沿颈正中皮肤切口，再用神经剥离器分离颈部双侧迷走神经，清晰暴露双侧颈总动脉，用无创动脉夹闭颈总动脉，阻断血流10 min，间隔10 min，再用无创动脉夹闭颈总动脉，阻断血流10 min，然后恢复血流。阻断的同时，剪鼠尾放血，造成全脑血流低灌注，最后热凝止血，造成急性脑缺血再灌注损伤动物模型。

假手术组：与造模组操作过程大致相同，但不阻断颈总动脉亦不放血。

1.3评价造模成功的标准

采用卒中指数评分标准［3］。卒中指数评分如下：毛发脏乱、全身颤抖各1分，运动减少或迟钝1分，耳触觉迟钝为3分，眼固定状睁开为3分，后肢外展呈八字为3分，上睑下垂为1分，转圈为3分，惊厥或爆发运动为3分，极度虚弱为6分。总分25分，＞10分明显有损伤。选取卒中指数＞10分的动物为造模成功的动物。

1.4指标检测

用流式细胞仪检测脑组织海马区Ca2+。用光学显微镜观察大鼠脑组织海马CA1区的形态学变化。

1.5统计学处理

2　结 果

2.1脑心通对脑缺血再灌注损伤大鼠卒中指数评

分的影响

大鼠的卒中指数评分步长脑心通组比模型组低，且随时间推移呈递减趋势。第1天，步长脑心通组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示脑缺血再灌注损伤模型制备成功，并且各用药组动物选取无差异；第6天，步长脑心通组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；第12天，步长脑心通组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），说明步长脑心通能显著改善模型大鼠神经行为症状和体征，有较好疗效，但中药治疗作用起效慢。见表1。

表1　脑缺血再灌注损伤大鼠卒中指数评分（±s）

表1　脑缺血再灌注损伤大鼠卒中指数评分（±s）

注：各组数据服从正态分布，组间方差齐性检验，P＞0.05；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，◇P＞0.05

组别　n　1 d　6 d　12 d模型组　10　15.40±0.966　10.40±1.075　9.50±0.850步长脑心通组　10　15.00±0.817◇　9.50±0.850◇　6.40±0.843**

2.2脑心通对脑缺血再灌注损伤大鼠脑海马组织细胞内Ca2+含量的影响

脑缺血再灌注后，与空白组、假手术组相比，模型组大鼠脑内海马组织细胞内Ca2+含量明显升高，说明模型组发生了明显的细胞内Ca2+超载作用；与模型组比较，脑心通组较模型组细胞内Ca2+含量均下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明脑心通可有效缓解脑缺血再灌注损伤后细胞内Ca2+超载作用。见表2。

表2　脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织细胞内Ca2+含量（±s）

表2　脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织细胞内Ca2+含量（±s）

注：各组数据服从正态分布，组间方差齐性检验，P＞0.05；与空白组、假手术组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

组别　n　Ca2+平均荧光强度空白组　10　1.6500±0.03232假手术组　10　1.6540±0.03062模型组　10　1.7880±0.03293**步长脑心通组　10　1.7280±0.03553**◇◇

2.3脑心通对脑缺血再灌注损伤大鼠脑海马组织结构的影响

脑心通可以减轻脑缺血再灌注引起的大鼠脑海马组织损伤，减轻神经细胞的水肿、变性、坏死等，保护及修复神经细胞。

①空白组及假手术组：海马CA1区神经细胞呈圆形或椭圆形，分布密集，排列规则。

②模型组：海马CA1区神经细胞排列稀疏、紊乱，丢失严重，胞浆内嗜酸性染色增强，细胞核固缩或细胞核形状不规则，周围间隙及血管间隙明显增宽。

③步长脑心通组：海马CA1区神经细胞稍稀疏，呈圆形，椭圆形，或多角形，细胞排列较有序。

空白组　（10×20）　

假手术组 （10×20）

模型组　（10×20）　

步长脑心通组 （10×20）

3　讨 论

Ca2+广泛分布于人体的细胞和体液之中，对细胞的代谢和功能有重要的调节作用，在中枢神经系统内，Ca2+被称为神经生理学家的“DNA”，它作为神经细胞内的重要信使，参与神经递质的合成与释放，以及神经细胞内多种酶学的转运等活动［4］。生理状态下，细胞内外钙离子保持动态平衡。当脑缺血再灌注时，Ca2+平衡遭到破坏，大量Ca2+内流引起Ca2+超载。首先能量代谢障碍，ATP耗竭，使Na+内流，K+外流，神经细胞模去极化，电压依赖性钙通道开放，Ca2+进入细胞内增加，同时能量耗竭，钙离子泵能量障碍，使细胞内Ca2+传出能力下降，可使细胞Ca2+内超载；但细胞内Ca2+增多主要是由敏感性、主动性的受体门控通道来完成，这些通道特别是NMDA-R激活引起门控性通道的开放，在缺血缺氧状态下由于谷氨酸的过多释放以及摄取障碍而被激活，导致细胞内的Ca2+超载，引起神经细胞病理性损伤。神经细胞内Ca2+超载时，可导致5-羟色胺及去甲肾上腺素释放增多，引起脑血管痉挛，局部血流变状况恶化，加重脑缺血；神经细胞内Ca2+超载时，大量Ca2+沉积于线粒体，与线粒体内含磷酸根的化合物结合，形成不溶性磷酸钙，造成氧化磷酸化电子传递脱耦联，致使膜电位丧失引起跨膜离子流失效，神经细胞呼吸功能受到抑制，导致不可逆性神经细胞损伤；神经细胞内Ca2+超载时，可致胞浆内或溶酶体内Ca2+依赖性酶类和磷脂酶类大量激活，使神经细胞膜结构分解，神经细胞骨架破坏，导致神经细胞死亡［5］；神经细胞内Ca2+超载时，可激活磷脂酶A2和磷脂酶C，使膜磷脂降解，产生大量游离脂肪酸，特别是花生四烯酸，造成脂质膜流动性降低及通透性增高，导致神经细胞肿胀，以及花生四烯酸在环氧酶及脂氧酶作用下生成前列腺素、白三烯和血小板激活因子等活性物质，并在氧自由基的作用下，启动膜脂质过氧化，形成脂性自由基，破坏生物膜，并进一步促进受体通道兴奋性氨基酸的释放，造成兴奋性氨基酸的毒性，加重神经细胞损害［6］。

本实验结果表明：中药复方制剂脑心通可以减轻脑缺血再灌注引起的大鼠脑海马组织损伤，减轻神经细胞的水肿、变性、坏死等，保护脑组织；还可以减少脑缺血再灌注后细胞外Ca2+通过电压依赖性通道和受体门控性通道进入细胞内，降低脑缺血再灌注引起的大鼠脑神经细胞内Ca2+的含量，从而可以防止细胞内Ca2+超载引起的一系列病理损伤，保护神经细胞。

［1］方正龙，袁灿兴，颜乾麟，等.步长脑心通胶囊治疗脑卒中的临床研究［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2003，1（1）: 32-34.

［2］何令学，尹海林.脑缺血动物模型的研究［J］.中国比较医学杂志，2004，15（4）:307-310.

［3］Zea Longa EL，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reyersible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.STROKE，2009，20:84-90.

［4］Farber JL. The role of calcium in cell death［J］.Life Sci，2010，29（13）:1289-1295.

［5］Lewen A，Matz P，Chan PH.Free radical pathways in CNS injury［J］. Neurotrauma， 2000， 17（10）: 871-890.

［6］Yang GY，Schielke GP，Gong C，et al.Expression of TNF-α and ICAM-1 afte rfocal cerebral ischemia in IL-βconverting enzyme deficient mice［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2009，19:1109.

本文编辑：徐 陌

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ISSN.2095-6681.2016.04.138.03