NtMAP70基因在烟草抗马铃薯Y病毒过程中的作用

詹琳琳, 郭玉双, 蔡健宇, 武晓云, 杨　靓

(1.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江 临安 311300；2.贵州省烟草科学研究院，烟草行业分子遗传重点实验室，贵州 贵阳 550081；3.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002)



NtMAP70基因在烟草抗马铃薯Y病毒过程中的作用

詹琳琳1, 郭玉双2, 蔡健宇1, 武晓云1, 杨靓3

(1.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江 临安 311300；2.贵州省烟草科学研究院，烟草行业分子遗传重点实验室，贵州 贵阳 550081；3.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002)

为了探明微管结合蛋白70(MAP70)在抗马铃薯Y病毒(PVY)中的作用机制，克隆了烟草NtMAP70基因的全长，并进行了生物信息学分析.利用实时荧光定量 PCR研究了该基因在烟草不同时期和不同部位中的表达水平，结果表明，NtMAP70在烟草的各个生长期均有表达，且在根中的表达量最高.构建了基于双生病毒卫星诱导的烟草NtMAP70的沉默载体，以中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)为辅助病毒在烟草中沉默了该基因.与对照相比，在NtMAP70基因沉默的烟草中PVY侵染速率明显减缓，病毒含量显著降低.

NtMAP70; 马铃薯Y病毒; 烟草； 抗性

马铃薯Y病毒(PotatovirusY, PVY)是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的典型成员，能侵染34个属170余种植物，以茄科植物为主，藜科和豆科次之，危害严重的作物有马铃薯、烟草、番茄等[1].烟草是我国的重要经济作物之一，近几年 PVY在我国烟区暴发成灾，并且存在逐年加重的趋势.PVY感染烟草症状：病株叶脉变暗褐色至黑色坏死，叶片呈斑驳花叶状、污黄褐色，有时坏死部分延伸至主脉和茎的韧皮部，病株根系发育不良，变褐腐烂.烟草的产量和品质受到严重影响.许多研究者试图寻找有效的防治途径，包括选育优良的抗病品种或筛选高效的防治药剂，但仍未取得理想的防治效果[2].因此，明确 PVY与植物相互作用的分子机制，挖掘植物内源的抗PVY基因，对于认识抗性本质并进行科学的遗传改良具有重要意义.

植物微管是一种具有极性的细胞骨架，于1963年首次被发现[3].随后研究者利用免疫荧光显微术和电镜技术对微管进行的研究发现，植物中微管、微丝、中间纤维三者共同构成了细胞质中三维网络结构的骨架系统.微管除了具有骨架功能外，还能对细胞壁构建、极性确定、有丝分裂、胞质流动等生理活动起作用.微管的这些功能不仅需要自身的微管蛋白，还需要微管结合蛋白(microtubule-associated proteins, MAPs)的参与[4-5].微管结合蛋白是经过反复的聚合—解聚多次超速离心后仍然能聚集到微管上与之共纯化的蛋白[6].MAP70是植物特有的与微管相互作用的蛋白[7-8].目前，有关MAP类基因是否参与植物对病原菌的抗性还未见报道.

在前期对烟草栽培品种“K326”感染PVY后转录组测序的研究中发现，烟草MAP70基因(http:∥www.solgenomics.net/, mRNA_84274)显著被PVY诱导.为了探明其在烟草抗PVY过程中的作用，同时为烟草的抗病育种提供依据，本研究首先克隆NtMAP70的全长，并进行生物信息学分析和表达模式研究；利用病毒介导的基因沉默技术，分析NtMAP70基因沉默情况下烟草对PVY抗性的变化.

1　材料与方法

1.1供试材料

烟草栽培品种“K326”、PVY脉坏死株系(PVYN)、大肠杆菌DH5α、农杆菌EHA105感受态均由贵州省烟草科学研究院提供.T载体购自Promega公司，PCR相关试剂及限制性内切酶购自TAKARA公司，T4连接酶购自NEB，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购于TIANGEN公司，其他常用化学药剂均为国产分析纯.

1.2试验方法

1.2.1样品总RNA的提取取烟草的根、叶，分别加入液氮，研磨成粉，使用Trizol法提取总RNA，-80 ℃保存备用.参照反转录试剂盒说明书合成cDNA第一链.

表1　引物及其序列1)Table 1　Primers and sequences

1)GGATCC是BamHⅠ酶切位点；TCTAGA是XbaⅠ酶切位点.

1.2.2NtMAP70全长及保守片段的克隆(1)引物设计.采用Primer Premier 5软件，根据MAP70基因序列设计全长及Real time检测引物.设计基因沉默片段引物时，为了使克隆片段便于与载体2mDNA1相连，在NtMAP70基因引物中添加BamHⅠ、XbaⅠ的限制性酶切位点(表1).

(2)片段克隆及检测.利用反转录的cDNA为模板进行PCR扩增.PCR反应体系：10×Buffer 2.5 μL，2.5 nmol·L-1dNTPs 2 μL，Taq酶0.5 μL，引物各1 μL，DNA模板1 μL，用水补至25 μL，然后离心混匀.PCR扩增条件：先94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，循环35次后，于72 ℃延伸10 min.

使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增产物，与T-Vector连接，转化大肠杆菌DH5α，交由上海捷瑞生物工程有限公司测序.

1.2.3NtMAP70植物沉默载体的构建参照Huang et al[9]建立的栽培烟草基因沉默体系,对测序正确的菌液进行质粒提取，用BamHⅠ、XbaⅠ双酶切并回收目的片段.将回收产物与同样酶切的沉默载体2mDNA1-Vector连接，构建沉默载体2mDNA1-NtMAP70.利用冻融法转入农杆菌菌株EHA105中.

1.2.4病毒接种将含有沉默载体2mDNA1-NtMAP70的农杆菌与含有辅助病毒中国番茄黄化曲叶病毒(TomatoyellowleafcurlChinavirus, TYLCCNV)的农杆菌以1∶1混合，通过注射接入烟草；以辅助病毒与空载体接种的烟草作为对照.

1.2.5病毒含量分析接种PVY 22 d后，分别取试验组(转入NtMAP70沉默载体)与对照组(转入空载体)的发病叶片以及健康烟草叶片[阴性对照(N)]，使用Agdia公司的PVY PathoScreen Kit检测不同处理中的病毒含量，并利用酶标仪测量并记录D405 nm.若样品D405 nm值与阴性对照D405 nm值的比值(D405 nm/N)≥1.5则可判断样品为PVY阳性(+);反之，D405 nm/N<1.5则判断为阴性(-).3组生物学重复.

1.2.6基因表达分析利用SYBR Green染料法在荧光定量Viia 7 PCR仪上反应，以延伸因子EF-1-α(elongation factor 1-alpha 1 gene)作为内参，定量分析NtMAP70基因的表达情况，引物设计见表1.PCR反应体系：SYBR Green 10 μL，DNA模板1 μL，引物各1 μL，用水补至20 μL，然后离心混匀.PCR扩增条件：先94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，循环35次后，于72 ℃延伸10 min.

2　结果与分析

2.1NtMAP70全长基因的克隆与序列分析

M.DL5000 marker;1.NtMAP70.图1　NtMAP70全长基因的克隆Fig.1　Cloning of full-length NtMAP70

对NtMAP70全长基因进行PCR克隆，得到2 897 bp的片段(图1)，经测序,其与sol数据库(http:∥www.solgenomics.net/)中mRNA_84274序列完全一致.用近邻相接法(MEGA 4.0)对不同植物MAP70进行进化分析，表明MAP70广泛存在于多种植物中，烟草NtMAP70与番茄、马铃薯亲缘关系最近(图2).

2.2NtMAP70基因的转录表达结果

实时荧光定量PCR检测表明，NtMAP70基因在烟草的幼苗期、旺长期和成熟期的根和叶中均有表达，且根中的表达量均高于叶片(图3)，这与MAP基因参与转运物质的生理功能相一致；根和叶中都是幼苗期的表达量最高，旺长期表达量最低，这可能由于幼苗期处于细胞生长旺盛阶段，微管组织结构大量合成，物质运输频繁，而旺长期、成熟期微管组织结构成熟，MAP70蛋白较幼苗期出现了大幅度减少.

图2　烟草NtMAP70与其他植物MAP70基因的系统进化树

图3　NtMAP70基因在烟草不同时期、不同部位的表达水平

2.3基因沉默载体的构建

用PCR扩增NtMAP70基因得到约500 bp的片段(图4)，将回收的载体片段与T载体连接，测序，挑选正确的克隆用于下一步研究.将目的片段与2mDNA1-Vector连接，获得重组质粒2mDNA1-NtMAP70，用BamHⅠ、XbaⅠ双酶切鉴定(图5).将沉默载体2mDNA1-NtMAP70转入农杆菌EHA105中.

M.DL2000 marker;1.NtMAP70.

M.DL2000 marker;1.NtMAP70.

2.4基因表达分析

在接种30 d时分别选取沉默植株和接种2mDNA1空载体植株的叶片，用Trizol法提取这些叶片的总RNA，再用Oligo d (T) 18引物合成cDNA第一链.利用RT-qPCR检测NtMAP70基因的表达水平，结果表明，与接种空载体植株中NtMAP70基因的表达量相比，接种沉默载体植株中目的基因的表达水平显著下调，约为对照的15%.

2.5表型调查

图6　接种PVY植株发病情况Fig.6　Incidence rate of PVY in tobacco inoculated with PVY

注射农杆菌30 d后，摩擦接种PVY，1周后开始观察并记录发病情况，每5 d记录一次.结果表明，NtMAP70基因沉默后，烟草的发病率明显低于对照(图6)，说明NtMAP70在烟草抗PVY的过程中具有负调控作用.选取接种22 d后的叶片，经PVY检测表明，对照组的平均D405 nm值为1.479，试验组为0.659，阴性对照为0.214；对照组D405 nm/N为6.922，试验组为3.083，两者皆为PVY阳性.这说明沉默NtMAP70后，虽然烟草依旧发病，但发病症状延缓，且其中PVY的含量降低，表明PVY复制受到了抑制.

3　讨论

在野生辣椒(Capsicumchinense)中克隆到一个与 PVY抗性有关的基因eIF4E-1，并证明该基因能与PVY的Vpg互作， 影响PVY在植物体内的复制[10],从而减轻PVY的症状. 在野生马铃薯(Solanumchacoense,S.demissum, andS.etuberosum)中也克隆到了eIF4E-1的同源基因Eva1，并证明该基因也有类似的功能[11].由于植物对病毒的抗性机理极为复杂，大量的新的植物抗PVY基因及抗病机理值得进一步挖掘.

本试验根据前期的研究结果，选取受PVY诱导的烟草微管结合蛋白NtMAP70作为研究对象，对其抗病毒作用进行了深入研究.通过病毒介导的基因沉默，在烟草中沉默了该基因，NtMAP70沉默后植株中PVY含量变少，发病慢，说明NtMAP70沉默在一定程度上抑制了PVY的复制并延缓了发病时间.由此可推测，NtMAP70对PVY侵染烟草有促进作用.其具体机理有待深入探究.

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(责任编辑:杨郁霞)

校园景色：

Role ofNtMAP70 in the resistance of tobacco to potato virus Y infection

ZHAN Linlin1, GUO Yushuang2, CAI Jianyu1, WU Xiaoyun1, YANG Liang3

(1.School of Agriculture and Food Science, Zhejiang A & F University, Lin′an, Zhejiang 311300, China; 2.Key Laboratory of Molecular Genetics, China National Tobacco Corporation, Guizhou Institute of Tobacco Science, Guiyang, Guizhou 550081,China; 3.College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To elucidate the mechanism of microtubule-associated protein 70 (MAP70) on combatingPotatovirusY(PVY), full-lengthNtMAP70 was firstly isolated, and transcriptional expression levels ofNtMAP70 in different organs and growing periods were measured by real-time quantitative PCR. ThenNtMAP70 gene silencing vector, based on geminivirus satellite, was introduced intoAgrobacteriumtumefaciensstrain EHA105. AndAgrobecteriumharboring recombinant silencing vector andTomatoyellowleafcurlChinavirus(TYLCCNV) infectious clone were co-agroinoculated into tobacco plants. Results showed thatNtMAP70 was expressed in all organs and growing periods, among which the expression levels was highest in the root. Compared with the control, PVY infection rate was lower in tobacco plants that inoculated with silenced gene so as a reduced level of PVY. To summarize, silencedNtMAP70 gene is very likely to suppress the proliferation of PVY and retard its activity.

NtMAP70; PVY; tobacco; resistance

2015-11-22

2016-01-05

国家自然科学基金(31360431).

詹琳琳(1990-),女，硕士研究生.研究方向：植物分子生物学.通讯作者郭玉双(1981-),女,副研究员.研究方向：分子植物病理学.Email:yshguo@126.com.

S435.72

A

1671-5470(2016)05-0556-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.05.013