液质法测定水产品中敌百虫、敌敌畏、甲胺磷

侯文慧

（乌兰察布职业学院，内蒙古乌兰察布012000）

液质法测定水产品中敌百虫、敌敌畏、甲胺磷

侯文慧

（乌兰察布职业学院，内蒙古乌兰察布012000）

采用超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中敌百虫、敌敌畏、甲胺磷的的含量。试样经0.1%甲酸-乙酸乙酯超声萃取，HC-C18固相萃取柱净化后，UPLCBEHC18色谱柱分离，选择离子监测（SIM），定量离子对（m/z）：258.7/ 127.0（敌百虫）、221.0/127.1（敌敌畏）、142.1/94.1（甲胺磷）；定性离子对（m/z）：258.7/109.0（敌百虫）、221.0/109.1（敌敌畏）、221.0/112.0（甲胺磷）。结果表明：敌百虫、敌敌畏、甲胺磷加标回收率在90.6%～106.0%之间，相对标准偏差不大于8.8%；以信噪比RSN=3计算，方法检出限均为1.5μg/kg，方法定量限均为5.0μg/kg。

超高效液相色谱-串联质谱法；敌百虫；敌敌畏；甲胺磷；水产品；测定

有机磷农药（Organophosphrous pesticides，简称OPPS）是含有C-P键或C-O-P、C-S-P、C-N-P键的有机化合物。作为杀虫剂，有机磷农药具有广谱、高效、量小以及作用方式多、使用方便、半衰期短等优点，广泛应用于农业、工业、医药等领域。但与此同时产生的环境问题也引起人们的关注，而且绝大多数有机磷农药是剧毒的，容易对人体或动物造成急性中毒，且对肝脏、肾脏、心脏、呼吸系统、生殖系统以及血液系统有一定毒害作用。由于在生产、管理及农业中滥用有机磷农药，使土壤、水源受到了污染，并影响到养殖用地和用水，使水产品含有有机磷农药的残留存在可能。敌百虫作为国标渔药广泛应用于水产养殖领域，其在碱性条件下分解成剧毒的敌敌畏，加上养殖用户非法使用甲胺磷等剧毒农药作为杀虫剂和消毒剂，给水产品中有机磷农药残留带来潜在的风险。此外，在咸鱼加工过程中非法使用敌百虫、敌敌畏、甲胺磷等有机磷农药浸泡来进行防腐，这严重威胁着消费者的身体健康。

目前，国内外对有机磷残留的检测方法主要是气相或气质，而该方法前处理复杂、耗时长、有机溶剂消耗多，且其在进样口衬管容易产生吸附，发生基质效应导致定量结果的不准确。而液相色谱-串联质谱法，其对极性有机磷检测时选择性更高，其对样品的前处理净化要求较气相或气质法相对较低，但目前国内外关于超高效液相色谱-串联质谱（简称：液质）法测定水产品中敌百虫、敌敌畏、甲胺磷残留的研究较少。本文以鱼、虾、咸鱼等水产品为研究对象，探索超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中敌百虫、敌敌畏、甲胺磷残留量的分析方法，为水产品监督部门、检测机构、水产品加工企业提供实际的应用参考。

1试验部分

1.1仪器与试剂

超高效液相色谱仪Waters Acquity UPLC系统配Quattro Premier XE串联四极杆质谱仪（美国沃特世公司）；XS-205型电子分析天平（赛多利斯北京有限公司）；Milli-Q型超纯水器（美国Millipore公司）；HY-3型多功能振荡器（常州国华电器公司）；0.22 μm有机微孔滤膜（天津津腾试验设备有限公司）；固相萃取装置（美国Supelco公司）。

敌百虫、敌敌畏、甲胺磷标准溶液（1.0 μg/mL）：分别准确称取敌百虫、敌敌畏、甲胺磷标准品100 mg（精确至0.1 mg），用65%乙腈水溶解后定容至100 mL。

鱼、虾、咸鱼：购自当地农贸超市。

所用试剂除特别标注外均为分析纯试剂，水为超纯水。

标准物质：敌百虫（trichlorfon，CAS：52-68-6）、敌敌畏（dichlorvos，CAS：62-73-7）、甲胺磷（methamidophos，CAS：10265-92-6），纯度均≥97%，购自美国SIGMA公司；乙腈、甲醇、正己烷（色谱纯，德国默克公司）；氮气、氩气（纯度≥99.99%，河南三门峡市荣鑫气体厂）；HC-C18固相萃取柱（500 mg/3 mL，美国安捷伦Agilent公司）。

1.2仪器工作条件

色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；柱温为35℃；流动相A为甲醇；流动相B为0.1%甲酸水溶液；流速为0.2mL/min；梯度洗脱程序见表1。

表1　梯度洗脱程序Table 1Gradient elution program of the mobile phase

质谱条件：电离方式，电喷雾电离，正离子模式，ESI（+）；检测方式：多反应监测（MRM）；其它质谱条件见表2。

1.3样品前处理

1.3.1罗非鱼、对虾等鲜活、冷冻样品

称取试样5 g于50 mL离心管中，加入4.0 g无水硫酸镁，再加入15 mL 0.1%甲酸-乙酸乙酯，振荡提取10 min，4 000 r/min离心5 min，将上清液转移至25 mL容量瓶中，残渣用10 mL 0.1%甲酸-乙酸乙酯重复提取1次，离心后合并上清液并定容至刻度。准确移取上述提取液5.00 mL于离心管中，于35℃水浴氮气吹至近干，加入2 mL 0.1%甲酸-乙腈超声2 min后再涡旋溶解，待净化。

1.3.2咸鱼制品

称取试样2.5 g于50 mL离心管中，加入2.0 g无水硫酸镁，余下步骤按1.3.1节操作“再加入15 mL 0.1%甲酸-乙酸乙酯，……，待净化”。

1.3.3净化

将1.3.1待净化溶液过HC-C18固相萃取柱，待自然流干后，用0.1%甲酸-乙腈4 mL清洗上述离心管，并将清洗液依次过柱，收集全部流出液体，35℃水浴氮气吹至近干，准确加入1.0 mL甲醇-甲酸水溶液超声2 min后再涡旋溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4标准曲线绘制

称取相同基质的空白试样6份，每份5 g，分别加入适量的标准工作溶液，制备成含敌百虫、敌敌畏、甲胺磷的浓度均为5.0、10、20、50、100、200 μg/kg的样品，按1.3进行操作，按1.2的仪器条件浓度由低到高进样测定，以特征离子色谱峰面积为纵坐标，敌百虫、敌敌畏、甲胺磷标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

2结果与讨论

2.1质谱条件优化

分别用甲醇将敌百虫、敌敌畏、甲胺磷标准储备液稀释成浓度均为1.0 μg/mL的单标溶液，分别以流动注射的方式在电喷雾离子源（ESI）进行正负离子扫描。首先对单一标准溶液进行全扫描观察其准分子离子峰，再进行二次质谱优化时得到子离子峰。结果发现：敌百虫、敌敌畏、甲胺磷均在正离子模式下具有丰度较高的母离子和子离子。每种待测物选择丰度最大的母离子及对应的两个响应值较高得子离子为定性离子，再以其中灵敏度最高、基质干扰小的子离子为定量离子，最终对2对特征离子对（定量离子对和定性离子对）进行多反应监测（MRM）参数优化，优化的参数详见表2。敌百虫、敌敌畏、甲胺磷的二级质谱图见图1、图2、图3。

表2　待测物定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞能量及碰撞池出口电压Table 2Determination of the ion pair，quantitative ion pair，the cluster voltage，and the impact of the collision energy meter

2.2UPLC色谱条件的优化

本试验采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×150 mm，1.7 μm）色谱柱分析。液质联用所用流动相可选范围较小，常用的为甲醇、乙腈、水及其不同比例的混合物和一些易挥发性盐的缓冲液。本研究考察了甲醇-水溶液流动相体系与甲醇-0.1%甲酸水溶液流动相体系对待测物峰形和灵敏度的影响。结果表明：在水溶液中加入少量甲酸有助于敌百虫、敌敌畏、甲胺磷等3种有机磷农药的离子化，响应值更高；敌百虫在酸性条件下稳定性好，避免其分解转化成敌敌畏对检测结果的影响。故选择甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相。为了进一步改善峰型缩短分析时间，采用了梯度洗脱，3种待测组分均在10 min内出峰，且峰型较好。

图1　敌百虫二级质谱图Fig.1Two mass spectra of trichlorfon

图2　敌敌畏二级质谱图Fig.2Two mass spectra of dichlorvos

图3　甲胺磷二级质谱图Fig.3Two mass spectra of methamidophos

2.3提取溶剂的选择

水产品中有机磷农药残留通常以二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈为提取溶剂。二氯甲烷毒性较大，且提取液在下层，移取时易吸出少量样品组织；丙酮共萃物较多，且与水互溶，此外，3种有机磷农药均在水中有较大溶解度，增加后续的除水步骤；由于敌敌畏在中性和碱性条件下稳定性较差，本研究考察了酸化乙腈和酸化乙酸乙酯的提取效果。结果表明，酸化乙腈的沸点较高且与水互溶，除水较困难，提取液浓缩耗时较长，对敌敌畏回收率的影响较大；酸化乙酸乙酯的沸点相对较低，水溶性较差，浓缩时耗时短，除水效果好，3种待测组分的回收率均较高。还比较了0.1%甲酸-乙酸乙酯、0.2%甲酸-乙酸乙酯、1.0%甲酸-乙酸乙酯等3种酸化乙酸乙酯对有机磷提取效率的影响，结果发现3种提取液对3种待测组分的提取效率的影响均较小，故最终选择提取溶剂为0.1%甲酸-乙酸乙酯。

2.4净化条件的优化

为达到理想的净化效果和回收率，本研究考察了液液萃取、分散固相萃取、固相萃取等3种常见净化方法对水产品中敌百虫、敌敌畏、甲胺磷测定的影响。用空白南美白对虾肌肉样品分别按照上述前处理方法（包括提取和净化）制备空白基质样品溶液后，加标浓度均为10.0 μg/kg，其加标回收率见图4。

图4　3种净化方式条件下的加标回收率（n=5）Fig.4The recoveries of spiked standard under the condition of 3 kinds of purification methods（n=5）

结果表明：3种净化方式后的溶液均为无色；采用分散固相萃取法与固相萃取法，敌百虫、甲胺磷的回收率均较高，而采用液液萃取法敌百虫、甲胺磷的回收率均在80%左右，其回收率明显低于采用分散固相萃取法与固相萃取法净化中敌百虫、甲胺磷的回收率；采用分散固相萃取法与液液萃取法，敌敌畏回收率均为30%左右；采用固相萃取法，敌敌畏回收率为60%左右，这可能与敌敌畏的沸点（74℃）较低，稳定性较差有关。故最终净化方式选择固相萃取。

2.5方法线性范围、检出限和定量限

称取相同基质的空白试样6份，每份5 g（咸鱼制品称取2.5 g），分别加入适量的标准工作溶液，制备成含敌百虫、敌敌畏、甲胺磷的浓度均为5.0、10、20、50、100、200 μg/kg的样品，按前处理方法进行操作，浓度由低到高进样分析测定。以质量浓度（X）为横坐标以峰面积（Y）为纵坐标，以峰面积对目标化合物的折算浓度建立回归直线方程。以3倍信噪比（S/N=3）计算方法定量限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）计算方法定量限（LOQ）。敌百虫、敌敌畏、甲胺磷在不同基质样品中的线性回归方程、相关系数、方法检出限、方法定量限见表3。

表3　敌百虫、敌敌畏、甲胺磷线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 3Linear equations，correlation coefficient，limit of detection and quantification of trichlorfon，dichlorvos and methamidophos

结果表明，3种有机磷农药在相应浓度范围内线性关系良好，相关系数（R2）在0.995 2～0.999 6之间。敌百虫、敌敌畏、甲胺磷的方法检出限（LOD）均为1.5 μg/kg，方法定量限（LOQ）均为5.0 μg/kg，满足国内水产品中对其残留限量的要求。

在空白阴性罗非鱼、南美白对虾、咸鱼样品中，分别添加5.0、10.0、50.0 μg/kg 3个浓度水平的3种有机磷农药，每个浓度水平设6个平行，同时设1个空白对照。敌百虫、敌敌畏、甲胺磷的加标回收率及相对标准偏差（RSD）结果见表4至表6。

表4　样品中敌百虫添加回收率和精密度Table 4Recovery and precision of trichlorfon in samples

表5　样品中敌敌畏添加回收率和精密度Table 5Recovery and precision of dichlorvos in samples

表6　样品中甲胺磷添加回收率和精密度Table 6Recovery and precision of methamidophos in samples

结果显示：在3种水产品基质中，敌百虫的平均加标回收率为93.7%～103.2%，精密度（相对标准偏差，RSD）为3.3%～8.1%；敌敌畏的平均加标回收率为90.6%～106.0%，精密度（RSD）为6.4%～8.8%；甲胺磷的平均加标回收率为94.5%～102.8%，精密度（RSD）为3.2%～7.3%。

2.6实际样品的检测

选取农贸市场待售的水产品（鲜鱼、虾、咸鱼），按照本文前处理和仪器条件进行上机测定，结果表明：不同来源的水产品样品中，敌百虫、敌敌畏、甲胺磷残留量有所差异，其中咸鱼样品中甲胺磷的残留量可达26.52 μg/kg。这说明在实际的水产品养殖、加工、运输、贮藏等过程中，敌百虫、敌敌畏、甲胺磷有可能作为杀虫剂而应用于水产品中。因此，为了确保水产品质量安全和维护消费者人身健康，相关行政部门有必要加强对敌百虫、敌敌畏、甲胺磷的行政监督与日常监测。

［1］夏秋媛，李芳秋.有机磷杀虫剂的免疫毒性及其机制的研究进展［J］.医学研究生学报，2009，22（1）：3-86

［2］Ragnarsdottir K V.Enviromental fate and toxicology of organophosphate pesticides：Environmental geochemistry and health［J］.Journal of the Geological Society，2000，157（4）：859-876

［3］杨立新，苗虹，曾凡刚，等.动物源性食品中有机磷农药残留检测技术研究进展［J］.中国食品卫生杂志，2010，22（3）：284-288

［4］刘琪，孙雷，张骊，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肝中有机磷农药残留量的研究［J］.分析测试学报，2010，29（7）：747-750

［5］王连珠，周昱，陈泳，等.QuEChERS样品前处理-液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中66种有机磷农药残留量方法评估［J］.色谱，2012，30（2）：146-153

［6］王国民，李应国，戴华，等.蜂蜜中多种有机磷农药残留的液相色谱串联质谱检测［J］.重庆大学学报，2011，37（7）：131-136

［7］张云，李耀平，李敏新，等.液相色谱-串联质谱法测定水产品中7种有机磷类农药残留物［J］.分析试验室，2009，28（S）：191-194

［8］王玉健，黄惠玲，董存柱，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中9种有机磷农药残留量［J］.理化检验-化学分册，2013，49（4）：398-404

［9］陈达炜，吕冰，李荷丽，等.腌制食品中敌敌畏和敌百虫检测的前处理方法研究［J］.中国食品卫生杂志，2014，26（3）：244-249

［10］李惠，苏晶，陶宏，陈长毅.高效液相色谱-串联质谱法同时测定涂料产品中4种有机磷阻燃剂［J］.理化检验-化学分册，2015，51（8）：1123-1126

Determination of Trichlorfon，Dichlorvos and Methamidophos in Aquatic Products by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

HOU Wen-hui
（Ulanqab Vocational College，Wulanchabu 012000，Inner Mongolia，China）

A method for determining the residues of trichlorfon，dichlorvos and methamidophos in aquatic products was established by an ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Samples was ultrasonic extracted with 0.1%formic acid-ethyl acetate，and purified with SPE-C18，and separated by UPLC BEH C18 column，and measured by selected ion monitoring（SIM）.The qualitative ion pair（m/z）was 258.7/127.0（trichlorfon），221.0/127.1（dichlorvos），and 142.1/94.1（methamidophos）；the quantitative ion pair（m/z）was 258.7/109.0（trichlorfon），221.0/109.1（dichlorvos），221.0/112.0（methamidophos）.The results showed that the recoveries were between 92.3%-106.0%，and the relative standard deviation were no more than 8.8%；According to RSN=3，the detection limits were 1.5 μg/kg quantitative，limits were 5.0 μg/kg.

ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry；trichlorfon；dichlorvos；methamidophos；aquatic products；determination

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.036

2015-12-29

侯文慧（1979—），男（汉），讲师，本科，研究方向：食品加工技术。