水稻粉质胚乳突变体ws的表型分析及基因克隆

潘鹏屹　朱建平　王云龙　郝媛媛　蔡跃　张文伟　江玲　王益华　万建民

(南京农业大学 作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部长江中下游粳稻生物学与遗传育种重点实验室/长江流域杂交水稻协同创新中心/江苏省现代作物生产中心，南京210095；*通讯联系人， E-mail: wanjm@njau.edu.cn)



水稻粉质胚乳突变体ws的表型分析及基因克隆

潘鹏屹朱建平王云龙郝媛媛蔡跃张文伟江玲王益华万建民*

(南京农业大学 作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部长江中下游粳稻生物学与遗传育种重点实验室/长江流域杂交水稻协同创新中心/江苏省现代作物生产中心，南京210095；*通讯联系人， E-mail: wanjm@njau.edu.cn)

PAN Pengyi, ZHU Jianping, WANG Yunlong, et al. Phenotyping and gene cloning of a floury endosperm mutantwsin rice. Chin J Rice Sci, 2016, 30(5): 447-457.

从甲基亚硝基脲(1-Methyl-1-Nitrosourea, MNU)处理的粳稻品种滇粳优1号突变体库中，筛选到一个稳定遗传的胚乳粉质突变体ws，其籽粒的千粒重、籽粒大小、总淀粉含量、直链淀粉含量等指标均降低，淀粉在尿素溶液中的膨胀能力减弱。对成熟及发育中的胚乳淀粉结构进行观察，发现ws突变体的胚乳中产生大量小而不规则排布的单淀粉颗粒。利用F2群体中分离出的92个隐性极端个体将突变基因连锁在第8染色体近着丝粒位置，随后共用2025个极端个体将目标基因定位于95 kb的区间。测序发现ws突变体中编码腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(Adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase, AGPase)小亚基S2的基因发生点突变，导致编码氨基酸的替换。基因表达分析发现，突变体胚乳中编码AGPase各亚基的相关基因表达量没有发生显著改变，而Western杂交分析显示突变体中AGPS2b的蛋白含量下降。同时，ws突变体的胚乳中AGPase活性下降为野生型的一半。研究结果表明，OsAGPS2的突变导致水稻胚乳中AGPase活性降低，从而影响了淀粉合成。

胚乳粉质突变体； AGPase； 淀粉； 基因表达； 理化性质； 水稻

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，世界上有1/3以上的人口以稻米为主食。淀粉作为水稻种子的主要贮藏物质，其结构和性质决定了稻米的外观品质和食味品质。因此，对淀粉合成相关基因的克隆和鉴定，不仅在科学上对阐明水稻淀粉合成及调控的分子机制，而且在育种上对改良稻米品质也具有重要的指导意义。

水稻的淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉两部分组成。直链淀粉是α-D-葡萄糖单位以α-1,4 糖苷键连接的线性葡聚糖链，基本无分支，或分支很少；支链淀粉是以α-D-葡萄糖为单位组成的高度分支葡聚糖，其分子分支内以α-1,4 糖苷键连接，分支间则以α-1,6 糖苷键相连[1]。淀粉的主要合成场所在造粉体，其生物合成是一个非常复杂的生物化学反应过程。叶片光合作用产物首先以蔗糖的形式运输到淀粉合成器官的胚乳细胞，转化为1-磷酸-葡萄糖(G-1-P)后进入造粉体内，在ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)、淀粉脱支酶(DBE)等的作用下形成直链淀粉或支链淀粉[2, 3]。

AGPase是淀粉合成代谢过程中涉及的第一个酶，其作用是将G-1-P 中的葡萄糖残基转移到ATP上形成焦磷酸和腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)[4]。ADPG生成后，在淀粉合成酶SS的催化下，葡萄糖残基以α-1,4 糖苷键掺入葡聚糖引物的非还原末端，延长一个葡萄糖单位，最终形成α-1,4 糖苷键连接的聚糖[4, 5]。聚糖又将作为淀粉分支酶的底物合成支链淀粉。颗粒结合淀粉合成酶(GBSSⅠ)是胚乳直链淀粉合成过程中的关键酶，由Wx基因编码[6, 7]。淀粉分支酶作用是催化α-1,4 糖苷键断裂，将释放出的寡聚糖链连接到葡聚糖链残基的C6羟基上，形成α-1,6 糖苷键，产生淀粉的支链[8, 9]。淀粉脱支酶(DBE)催化水解α-1,6 糖苷键，根据DBE作用底物的不同，可将DBE分为普鲁兰酶(PUL)和异淀粉酶(ISA)[10, 11]。

作为水稻胚乳淀粉合成途径中的上游关键酶，AGPase参与淀粉合成底物ADPG的合成。细菌中的AGPase是以由glgC基因编码的亚基所形成的同源四聚体形式存在[12]，而在高等植物体中，AGPase是由两个大亚基和两个小亚基所构成的异源四聚体[13, 14]，它们由不同的基因编码。水稻中编码AGPase异源四聚体小亚基的基因有两个，即OsAGPS1和OsAGPS2，其中OsAGPS2可以通过可变剪切产生两类mRNA，分别在叶片和胚乳中特异性表达，其翻译产物为OsAGPS2a和 OsAGPS2b；编码异源四聚体大亚基的基因有四个，即OsAGPL1、OsAGPL2、OsAGPL3和OsAGPL4[15]。相关研究显示，AGPase的催化功能由大小亚基相互协调起作用[16]。在水稻的胚乳发育过程中，OsAGPL1、OsAGPL2、OsAGPS1和OsAGPS2b表达量相对较高[3]。研究发现，在谷类作物籽粒灌浆期间，胚乳的AGPase活性主要存在于胞质中[17, 18]。OsAGPL2和OsAGPS2定位在胞质，其各自的缺失突变体sug、shr中淀粉合成受到显著影响，产生皱缩胚乳；OsAGPS2的缺失还会引起造粉体、质体发育异常[19, 20]。在大麦突变体risø 16中，AGPase的小亚基发生缺失，其籽粒的淀粉含量及质量分别下降为野生型的44%和72%[21]。而当AGPase活性上调时，水稻、玉米等作物的籽粒质量增加[22, 23]。因此，AGPase是淀粉生物合成的关键酶，对胚乳中淀粉的合成具有重要影响。

在对淀粉合成相关基因的研究中，人们通过寻找胚乳粉质突变体来揭示更多的调控机制。已报道的胚乳粉质突变体有flo1～flo7等，它们的表型包括胚乳粉质、皱缩、垩白等。突变体flo1直链淀粉含量较高，其突变基因位于第5染色体上[24]；FLO2编码一个包含三角四肽重复基序的蛋白，其突变体表现为粉质胚乳，籽粒变小[25]；flo3中16kD蛋白含量降低，突变基因位于第4染色体上[26]；flo4与flo5突变体胚乳均呈心白状，其中FLO4编码磷酸丙酮酸双激酶，它可能通过调节胚乳中的碳氮代谢来影响淀粉合成[27]，而flo5突变体则是OsSSⅢa缺失突变体[28]；FLO6基因编码一个包含529个氨基酸的未知功能的蛋白，具有淀粉结合活性并能与异淀粉酶ISA1互作[29]；FLO7基因编码一个功能未知的调节因子，它影响淀粉合成及造粉体发育，其突变体表型为胚乳外圈呈白色粉质状[30]。以上突变体和基因的发现，为更全面地阐明淀粉的生物合成途径奠定了基础。

在以往的实验中，我们筛选获得了一个AGPS2基因发生点突变的水稻突变体ws，其胚乳表现为粉质、不透明状。本研究对ws突变体籽粒的理化性质以及胚乳淀粉结构进行了观察，分析了不同组织和不同发育时期胚乳中相关基因的表达情况及AGPase、UGPase的活性，旨在进一步明确AGPase对淀粉合成的作用及其亚基间的关系。

1　材料与方法

1.1材料种植

ws是粳稻品种滇粳优1号经1 mmol/L MNU诱变后从中筛选得到的粉质突变体材料，因胚乳表型为白色不透明和轻微皱缩，将其命名为ws(whiteandshrunken)，其胚乳粉质性状稳定遗传。将其与籼稻品种南京11配制杂交组合用于基因的精细定位。水稻植株生长于南京农业大学牌楼实验基地及土桥实验基地，田间管理同一般大田。

1.2成熟种子理化指标测定

将成熟种子去壳后磨成糙米粉进行测定。直链淀粉含量测定按照农业部标准NY147-88进行；总淀粉含量使用Megazyme总淀粉测定试剂盒测定；总蛋白含量使用FOSS公司Kjeltec 2300型全自动凯氏定氮仪测定，总脂肪含量使用FOSS公司Soxtec 2050全自动脂肪测定仪测定。每个样品重复3次，取平均值。

1.3米粉的尿素膨胀体积

分别配制浓度为0～9 mol/L的尿素溶液，均用醋酸调节pH值至6.0。在1.5 mL EP管中分别加入上述尿素溶液1 mL以及20 mg糙米粉，混合均匀后在25℃下孵育24 h。室温、8000g下离心20 min，静置1 h。计算各EP管中可溶尿素部分的体积，淀粉颗粒的膨胀体积=总体积(1 mL)-可溶部分体积。每个样品设置3个重复，取平均值。

1.4成熟种子横切面扫描电镜观察

扫描电镜观察按照前人方法[27]进行。将成熟种子从中间部分横切制成样品后，在3%的戊二醛溶液中室温浸泡3 h，然后用0.1 mol/L的磷酸钠溶液(pH为6.8)冲洗3～5次，每次进行15 min。接着用2%的四氧化锇溶液4℃下固定过夜，固定后的样品用0.1 mol/L的磷酸钠溶液(pH 6.8)冲洗2～3次，每次15 min，然后用70%、80%、95%、100%乙醇溶液逐级脱水，每次5 min，再在乙醇-异戊基醋酸(体积比为1∶3)混合液中浸泡1 h，取出干燥，最后用金粉包被，在日立S-3000N型扫描电子显微镜下观察(加速电压为10～20 kV)。

1.5胚乳半薄切片观察

按前人所述方法进行[29]。取花后9、12 d的胚乳，切成厚度1～2 mm的薄片，放入固定液中进行固定。12 h后将样品取出用PBS漂洗3次，然后于4℃下，依次用30%、50%乙醇对样品进行脱水处理，每次15 min。然后在-20℃下用70%乙醇溶液对样品脱水处理两次，每次30 min。脱水处理后的样品使用LR WHITE树脂进行渗透、包埋、聚合等，操作过程按照其说明进行。对聚合后的胶囊进行修块，然后使用Leica RM2265全自动半薄轮转式切片机将其切成1 μm的切片。切片用1%的I2-KI溶液进行染色后，在Zeiss AX10荧光显微镜下观察。半薄切片固定液配方为2%(质量体积比)多聚甲醛、 2%(体积比)戊二醛、250 mmol/L蔗糖、50 mmol/L PIPES-KOH，pH值7.2。

1.6WS基因的图位克隆

我们配制了ws与南京11的杂交组合用于基因定位。在F1植株上收取F2种子，挑选其中与ws突变体一样表现为粉质不透明的F2种子，发芽后提取幼苗DNA进行基因的精细定位。标记的开发基于NCBI、Gramene等网站，测序由南京金斯瑞公司完成。基因组DNA采用CTAB法提取[31]。PCR体系如下：1 μL DNA模板(约20 ng)，1 μL引物(0.2 μmol/L)，1 μL dNTP (50 μmol/L)，1 μL 10 × 缓冲液(含Mg2+)和0.1 μLTaq(5 U/μL)DNA聚合酶(TaKaRa，大连)，用ddH2O补足10 μL。PCR程序如下：94℃下 5 min，94℃下 30 s，55℃下 30 s，72℃下 40 s，35个循环；72℃下 10 min，4℃下保存。PCR产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。

1.7AGPase相关基因的表达分析

取花后12 d胚乳、发芽后7 d植株幼苗叶片，使用TIANGEN公司的植物总RNA提取试剂盒提取RNA，反转录得到cDNA后使用SYBR premix Ex TaqTM(TaKaRa)试剂盒，在ABI PRISM 7500HT上扩增，进行实时定量PCR。反应体系包括1.8 μL cDNA模板，10 μL 2 × SYBR Premix ExTaqⅡ，0.8 μL 10 μmol/L PCR 正向引物，0.8 μL 10 μmol/L PCR反向引物，用ddH2O补足至20 μL。反应程序采用两步法：第一步95℃下预变性30 s，95℃下 5 s，60℃下 30 s，进行40个循环；第二步95℃下 15 s，60℃下 1 min，95℃下 15 s。用2-△△CT法对实时定量PCR实验的结果进行分析，以水稻Actin基因作为内参。所用引物部分参照前人所述[25]。

表1WS基因定位引物的序列

Table 1. Markers for fine mapping of WS.

标记Marker正向引物Forward(5'→3')反向引物Reverse(5'→3')HY8-19TTTGTTGCTTTTCTGATTCATGATAAAGCGATAAACCAWQ8-28GAGACGGACGGGTGTTGACAATGACATCCCAGCGTAWZ8-17TAAATCATGGTGGTGGGCACCGTCGTCTAGCAAGGAGWZ8-3ATTAAGATGATATGGGAAGTACATTGACCTGGTAGAAACHY8-24ATTAAGATGATATGGGAAGTACATTGACCTGGTAGAAAC

表2实时RT-PCR引物序列

Table 2. Primers used in real-time RT-PCR.

基因Gene正向引物Forward(5'→3')反向引物Reverse(5'→3')AGPL1CATCAAGGACGGGAAGGTCAACTTCACTCGGGGCAGCTTAAGPL2CTGAGGAAGAGGTGCTTTGGTCTTTCGGGAGGATTGTGTCAGPS1AGAATGCTCGTATTGGAGAAAATGGGCAGCATGGAATAAACCACAGPS2aACTCCAAGAGCTCGCAGACCGCCTGTAGTTGGCACCCAGAAGPS2bAACAATCGAAGCGCGAGAAAGCCTGTAGTTGGCACCCAGAUGPase1CCATCACCGCCAAGTCAGACCGTTGATGTCCTTGTTCTActinCCCTCCTGAAAGGAAGTACAGTGTGTCCGAAGAATTAGAAGCATTTCC

1.8蛋白Western-blot分析

取花后12 d胚乳提取总蛋白进行电泳。浓缩胶浓度为6%，分离胶使用8%～15%的梯度胶。浓缩胶时采用80V电压，蛋白质电泳至分离胶后，将电压升到120 V，根据预染标记条带及目标蛋白大小判断电泳停止时间，剥胶后转膜采用Bio-rad公司的湿转系统。PVDF膜(Minipore, 0.45 μm)在封闭液中孵育1 h后，转移至用封闭液稀释的一抗溶液中(1∶1000)，室温孵育2 h；接着用10 mmol/L PBST溶液漂洗3次，每次15 min；再将PVDF膜转移至用封闭液稀释的HRP标记的二抗溶液中(1∶5000)，室温孵育1 h后，重复上述漂洗过程；最后使用ECL化学发光(Tannon)检测杂交信号。封闭液为5%脱脂牛奶，用10 mmol/L PBST溶解。抗体由ABclonal公司制备。内参抗体为Sigma公司的Anti-α-Tubulin单克隆抗体(T5168)。

1.9酶活测定

AGPase活性测定参照前人所述方法[32]。在1.5 mL管中依次加入100 μL ADPG(14 mmol/L)、50 μL MgCl2(50 mmol/L)、700 μL HEPES-NaOH和50 μL粗酶液，30℃下预热10 min后加入100 μL PPi(20 mmol/L)，起始反应，30℃下水浴15 min。沸水煮2 min，终止反应。待溶液冷却至室温后加入100 μL NADP(20 mmol/L)，1.5 U的磷酸葡萄糖变位酶和1.375 U的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，再加入300 μL的HEPES-NaOH，30℃下水浴10 min后测定OD340吸光值。粗酶液提取方法如下：取5粒发育中的水稻籽粒，剥取其胚乳于EP管中，称重后加入10倍体积的提取液，充分研磨后在4℃、20 000g下离心10 min，取上清液即为粗酶液。提取液配方为50 mmol/L HEPES，2 mmol/L MgCl2，50 mmol/L β-巯基乙醇，12.5% 甘油(V/V)，用2 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.4～7.5，加水补足。类似地，测定UGPase活性时，在1.5 mL管中依次加入100 μL UDPG(14 mmol/L)，50 μL MgCl2(50 mmol/L)，700 μL HEPES-NaOH和20 μL粗酶液，后续步骤同AGPase测定。

2　结果与分析

2.1ws突变体表型及农艺性状分析

从1 mmol/L MNU处理的滇粳优1号突变体库中筛选获得的胚乳性状突变体，其成熟种子的胚乳呈粉质、不透明状，而滇粳优1号成熟种子的胚乳为透明状(图1-A、B)。与野生型相比，突变体成熟种子的千粒重下降36%，同时其粒长、粒宽、粒厚也均有显著降低(图2-A、B)。此外，ws突变体的株高仅为野生型的88%，结实率为野生型的70%，一次枝梗数也由15个减少至12个(图1-C，图2-C)。

2.2ws突变体成熟籽粒的理化性质分析

ws突变体的成熟籽粒中总淀粉含量和直链淀粉含量仅为野生型的79%和83%。

同时，ws突变体成熟籽粒的脂肪含量相比野生型上升了48%，蛋白质含量上升了44%(图3-A)。

A-野生型与ws突变体种子表型比较，标尺为3 mm； B-野生型与ws突变体种子横切面，标尺为1 mm； C-野生型与ws突变体植株，标尺为20 cm。DJY-滇粳优1号(野生型)。

A, Comparison of wild-type andwsmutant seeds, bar = 3 mm; B, Seed cross-sections of wild-type andwsmutant, bar = 1 mm; C, Comparison of wild-type andwsmutant plants, bar = 20 cm. DJY， Dianjingyou 1(wild type).

图1野生型与ws突变体的表型比较

Fig. 1. Phenotype comparison of the wild-type and ws mutant.

在尿素溶解性上，试验结果表明ws突变体较野生型更难溶于尿素(图3-B、D)。在尿素浓度达到4 mol/L时，野生型的米粉开始明显地溶解，而在突变体中直到尿素浓度达到7 mol/L才观察到与之相当的溶解量(图3-C、D)。尿素膨胀结果表明，ws突变体中支链淀粉结构发生改变。

2.3ws突变体成熟种子的扫描电镜观察

利用扫描电镜观察ws突变体及其野生型成熟籽粒的横断面，可以发现野生型籽粒横断面的淀粉颗粒多为排列紧密的多面体结构(图4-A、B)，而在突变体籽粒横断面则观察到大量小而不规则排布的淀粉颗粒结构(图4-C、D)，说明ws突变体成熟籽粒中的淀粉结构发生改变。突变体籽粒中淀粉结构的改变可能会使得光线通过时发生散射而导致突变体籽粒呈现不透明状。

2.4ws胚乳发育过程中淀粉结构的半薄切片观察

对发育过程中的胚乳进行半薄切片后，观察其淀粉颗粒的结构，发现在野生型滇粳优1号胚乳细胞中，存在许多复合淀粉颗粒，每个复合淀粉颗粒由多个单淀粉颗粒组成，属于典型的水稻复合淀粉颗粒结构(图5-A～C)。在对ws突变体的胚乳细胞进行观察时发现，突变体的胚乳细胞中存在大量单淀粉颗粒，复合淀粉颗粒相对较少，且排列松散，显示ws突变体的胚乳发育过程中淀粉颗粒形成异常(图5-D～F)。

千粒重n= 3，其余n= 10，取平均值±SD； 采用t测验，**表示P< 0.01。DJY-滇粳优1号(野生型)。

Values are mean ± SD (n= 10, except for 1000-grain weight,n= 3);t-test,**P< 0.01. DJY， Dianjingyou 1(wild type).

图2野生型与ws突变体的千粒重、籽粒及主要农艺性状比较

Fig. 2. Comparison of 1000-grain weight, seed and major agronomic traits of wild-type and ws mutant.

A-野生型与ws突变体籽粒的化学成分分析(Mean±SD)，n= 3，**，P< 0.01(t测验)； B-野生型与ws突变体的尿素膨胀； C-4 mol/L的尿素浓度下出现显著差异； D-不同尿素浓度下野生型和突变体的米粉的膨胀体积比较(n= 3)。DJY-滇粳优1号(野生型)。

A, Comparison of chemical composition of wild-type andwsseeds, values are mean ±SD,n= 3;t-test,**P< 0.01; B, Gelatinization properties of wild type andwsmutant seeds; C, Significant difference was observed at the urea concentration of 4 mol/L urea; D, The swollen volume of wild-type andwsstarch in urea solutions of various concentrations (n= 3). DJY， Dianjingyou 1(wild type).

图3野生型与ws突变体成熟籽粒的理化性质分析

Fig. 3. Physicochemical characteristics of wild-type and ws mature seeds.

2.5WS基因的精细定位

将ws与南京11配制杂交组合，从F1植株上收获的种子(F2)中挑选与ws突变体相同的胚乳粉质不透明籽粒进行基因定位。首先用92个极端个体将该基因连锁在第8染色体近着丝粒的区段内(图6-A)，随后扩大定位群体，最终利用2025个胚乳粉质不透明个体将基因定位在了标记WQ8-28与WZ8-17之间约95 kb区域内(图6-B)。在水稻数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)查询此区域内有5个预测的开放读码框(Open Reading Frame，ORF，图6-C)，其中基因Os08g0345800与淀粉合成直接相关，编码腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的一个小亚基(AGPS2)。对突变体该基因测序发现，在其编码区第三个外显子上，第548位核苷酸(AGPS2b序列)发生由C到T的改变，导致第183位氨基酸由极性的苏氨酸(Thr)变为非极性的异亮氨酸(Ile)(图6-D)。

2.6ws突变体及野生型中的相关基因表达及酶活分析

为了分析AGPS2b的表达模式，通过RT-PCR分析野生型中不同组织以及不同发育时期胚乳中AGPS2b的表达水平。结果表明，AGPS2b在穗中表达量最高，而茎中表达量较低(图7-A)。同时，AGPS2b在发育中后期的胚乳中表达量较高(图7-B)。分析发芽7 d后的幼苗，发现突变体叶片中AGPS2a表达量较野生型极显著降低(图7-C)。采取同样的方法比较了开花后12 d的野生型与突变体胚乳中编码AGPase各亚基相关基因的表达水平。与野生型相比，ws突变体中编码AGPase各亚基的相关基因的表达量没有发生显著改变(图7-D)。提取开花后12 d胚乳中的总蛋白进行Western-Blot分析，发现ws突变体中的AGPS2b蛋白水平显著降低(图7-E)。FLO4、PHO1为选取的影响淀粉合成的蛋白，其水平没有发生显著改变。酶活测定显示，ws突变体胚乳中AGPase活性降至野生型的一半，而UGPase(UDP-glucose pyrophosphorylase)活性则有略有上升(图7-F)。

A，B-野生型胚乳； C，D-ws突变体胚乳。A，C为籽粒横切面，标尺为1 mm； B，D是局部放大后的胚乳淀粉结构(红色方框内)，标尺为10 μm。

A, B, Endosperm of wild-type; C, D, Endosperm ofwsmutant; A, C, Endosperm cross-section, Bars = 1 mm; B, D, Partial enlarged drawing picture, Bars = 10 μm.

图4野生型与ws突变体成熟籽粒的扫描电镜观察

Fig. 4. Scanning electron microscopy observation of mature seeds of wild type and ws mutant.

3　讨论

本研究中，我们通过筛选经MNU处理的滇粳优1号突变体库，得到了一份胚乳呈粉质不透明的突变体。分析突变体成熟籽粒的理化性质，发现突变体成熟籽粒中的淀粉积累量以及支链淀粉结构发生了改变。通过对突变体籽粒的横断面进行扫描电镜观察，我们发现突变体胚乳中淀粉结构呈现小而不规则排列状，这可能是导致其胚乳呈现不透明的直接原因。利用半薄切片进一步分析了突变体发育过程中的胚乳，发现其发育中胚乳的淀粉结构也出现异常，具体表现为复合淀粉颗粒较少，而存在大量单淀粉颗粒。这些结果说明突变体胚乳从发育直至成熟阶段的淀粉合成与积累出现了异常。通过图位克隆，我们发现ws突变体中编码AGPS2的基因发生了单碱基替换，导致编码氨基酸的改变。

A，B-开花后9 d野生型胚乳细胞外围、里层； C-开花后12 d野生型胚乳细胞里层； D，E-开花后9 d的ws突变体胚乳细胞外围、里层； F-开花后12 d的ws突变体胚乳细胞里层。A，D标尺是100 μm，B，C，E，F标尺是50 μm。

A, B, Peripheral part (A) and central part (B) of wild-type endosperm cells at 9 DAF (days after flowering); C, Central part of wild-type endosperm cells at 12 DAF; D, E, Peripheral part (D) and central part (E) ofwsendosperm cells at 9 DAF; F, Central part ofwsendosperm cells at 12 DAF. Bars = 100 μm in A and D, 50 μm in B, C, E, F.

图5野生型与ws突变体胚乳的半薄切片观察

Fig. 5. Semi-thin sections of wild type and ws mutant seeds.

AGPS2b定位在胞质[8]。大时报道证明，谷类作物胚乳中的APGase主要存在于细胞质。在玉米胚乳中，质体中AGPase活性只占其体内所有AGPase活性的5%[33]，而大麦中的质体APGase活性也仅占15%[34]。玉米突变体Bt2中，AGPS2发生突变，体内的AGPase活性显著降低[35]。同样，在水稻胚乳中，研究已发现大部分AGPase的活性表现在质体之外，质体中的APGase活性只占10%[36]。在本研究中，由于ws突变体的APGS2发生了点突变，其整体AGPase酶活下降至野生型的一半左右，这是导致突变体淀粉合成出现异常的主要原因。

A-WS基因与标记HY8-19和HY8-24连锁； B-利用2025个极端个体将WS基因定位在95 kb区间内； C-WS候选基因分析； D-突变体AGPS2中发生单碱基替换(红色标出)，AGPS2由10个外显子(黑色方框表示)和9个内含子组成，AGPS2a与AGPS2b的第一个外显子分别为1a与1b。

A,WSwas linked with markers HY8-19 and HY8-24; B,WSwas located in a 95 kb region based on 2025 individuals; C, Candidate genes forWS; D,wsdisplayed a single nucleotide substitution inAGPS2 (in red)，AGPS2 is composed of 10 exons (filled box) and 9 introns, the alternative use of exon 1a and 1b generatesAGPS2aandAGPS2btranscripts, respectively.

图6WS基因的精细定位

Fig. 6. Fine-mapping of WS gene.

在之前的报道中，AGPS2的缺失导致胚乳出现粉质表型，并且明显皱缩[19, 20]。在本研究中，我们发现ws具有一个新的突变位点，虽然AGPS2的表达水平没有显著变化，但AGPS2b蛋白量降低。从籽粒外观上来看，ws突变体没有出现非常严重的皱缩现象。另外，在ws突变体中，编码AGPase各亚基的相关基因表达水平没有发生明显变化。

近年来，有许多研究者着眼于探究高等植物中AGPase异源四聚体各亚基之间的关系。按照普遍的观点，AGPase的催化活性主要由小亚基(SSU)提供，而大亚基(LSU)则起结构调控作用。

研究者最初在马铃薯中发现，由SSU形成的同源四聚体具有催化活性，在适当的条件下它甚至能具有与正常的由异源四聚体构成的AGPase一样的催化能力[37, 38]。在拟南芥中也有类似的报道[39]。相比之下，马铃薯中的LSU形成的同源四聚体并不具有催化活性[37]。拟南芥中AGPL3与AGPL4的同源四聚体活性较弱，而拟南芥AGPL1、AGPL2以及番茄AGPL3的同源四聚体则具有较强的活性[40, 41]，这说明高等植物中的LSU有不同的催化特性。Tuncel等[42]报道，LSU对于AGPase的功能发挥与结构调节都是必不可少的，AGPL2能够提高S2亚基的稳定性，且缺失AGPL2时AGPase活性降低。从本研究的结果来看，突变体ws中AGPS2的突变导致AGPase活性降低，进一步证明了AGPase中SSU提供主要催化活性的观点。同时ws中AGPL2的基因表达水平及蛋白积累量没有发生改变，说明AGPS2对AGPL2的表达没有直接的影响。

A-野生型不同组织中AGPS2b的表达分析； B-野生型不同发育时期胚乳中AGPS2b的表达分析； C-野生型和ws突变体发芽7 d后幼苗叶片中AGPS2a表达分析； D-野生型与ws突变体发育中胚乳的AGPase相关基因表达分析； E-野生型与ws突变体发育中胚乳的相关蛋白表达分析； F-野生型和ws突变体发育胚乳中AGPase和UGPase活性测定。A，B，C，D，F中，n= 3，取平均值±SD。

A, Real-time RT-PCR analysis of the expression ofAGPS2bin different organs in wild type; B, Real-time RT-PCR analysis of the expression ofAGPS2bat different developing stages of endosperm in wild type; C, Real-time RT-PCR analysis of the expression ofAGPS2ain leaves of the wild type andwsmutant seedlings at 7 days after germination; D, Real-time RT-PCR analysis of the expression of genes encoding AGPase in wild type andwsmutant endosperm; E, Immunoblot analysis of starch biosynthesis related proteins in wild type andwsmutant endosperm; F, AGPase and UGPase activities of wild-type andwsdeveloping endosperm. For A, B, C, D and F， error bars showSD(n= 3).

图7野生型及ws突变体中的相关基因表达及酶活分析

Fig. 7. Expression of related genes and enzyme activity in wild type and ws mutant.

本研究主要对ws突变体的胚乳淀粉合成进行了分析，然而在对ws突变体农艺性状的观察中，我们可以发现，ws突变体的植株高度、一次枝梗数以及结实率均低于野生型。在对AGPS2进行组织表达分析时也发现，AGPS2在穗以外的其他组织中也有一定的表达量。分析发芽7 d后的幼苗，发现突变体叶片中AGPS2a表达量较野生型极显著降低，由此我们推测突变体叶片中的淀粉合成受到影响，因而可能进一步造成突变体植株的表型变化。这些结果说明AGPase除了参与调控胚乳中淀粉合成以外，还在植物的其他部位及生长时期发挥作用。因此，对于AGPase及编码其各亚基相关基因的深入研究，对揭示水稻中胚乳淀粉合成及更多生物代谢过程具有重要意义。

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Phenotyping and Gene Cloning of a Floury Endosperm Mutant ws in Rice

PAN Peng-yi, ZHU Jian-ping, WANG Yun-long, HAO Yuan-yuan, CAI Yue, ZHANG Wen-wei, JIANG Ling, WANG Yi-hua, WAN Jian-min*

(State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Biology, Genetics and Breeding of japonica Rice in Mid-lower Yangtze River, Ministry of Agriculture/The Yangtze River Valley Hybrid Rice Collaboration Innovation Center/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production, Nanjing 210095, China;*Corresponding author, E-mail: wanjm@njau.edu.cn)

In this study, we obtained a stably inherited floury endosperm mutantwsfromjaponicavariety cv. Dianjingyou 1 (DJY), with its 1000-grain weight, grain size, total starch content, and amylose content in mature seeds all decreased compared with wild-type, as well as the swelling power of starch. By observing the structure of mature and developing endosperm, we found that the starch granules inwsmutant were smaller and loosely packed. TheWSlocus was first mapped to a region near the centromere in chromosome 8 with 92 recessive individuals, and then was narrowed down to a 95 kb region by using 2025 recessive individuals. Sequence analysis revealed that the coding region of thesmallsubunitofadenosinediphosphateglucosepyrophosphorylase(AGPS2) had a single nucleotide substitution, resulting in a change in the amino acid sequence. RT-PCR analysis showed no significant difference in the expression levels of genes encoding the AGPase subunits in the mutant endosperm, while immunoblot analysis revealed a reduced protein content of the AGPS2b. Meanwhile, the enzyme activity of AGPase in the mutant was decreased to half of the wild-type. These results showed that the mutation ofOsAGPS2 caused the decreased activity of AGPase, thus affecting the starch biosynthesis in rice endosperm.

floury endosperm mutant; AGPase; starch; gene expression; physicochemical property; rice (OryzasativaL.)

2016-03-19； 修改稿收到日期: 2016-04-28。

国家转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08001006); 国家自然科学基金资助项目(31371598)； 江苏省科技支撑计划资助项目(BE2014394)； 农业部长江中下游粳稻生物学与遗传育种重点实验室、长江流域杂交水稻协同创新中心、江苏省现代作物生产中心资助项目。

Q343.5; Q785; S511.01

A

1001-7216(2016)05-0447-11

潘鹏屹, 朱建平, 王云龙, 等. 水稻粉质胚乳突变体ws的表型分析及基因克隆. 中国水稻科学， 2016， 30(5)： 447-457.