不同中医证型肺结核患者外周血CD14+单核细胞IL-1β、IL-1Ra表达水平的差异

张国良　王玲玲　詹森林　曹廷智　汪文斐　张红梅　邓群益　聂广



不同中医证型肺结核患者外周血CD14+单核细胞IL-1β、IL-1Ra表达水平的差异

张国良王玲玲詹森林曹廷智汪文斐张红梅邓群益聂广

目的探讨肺结核患者不同中医证型与CD14+单核细胞白介素-1β(interleukine-1β,IL-1β)、白介素-1受体拮抗剂(interleukine-1 receptor anlagenist,IL-1Ra)表达水平的相关性。 方法选取104例肺结核确诊患者为研究对象，其中肺阴亏虚33例，阴虚火旺36例，气阴两虚35例。采集抗凝血并利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，与CD14+免疫磁珠孵育后获得单核细胞，使用结核杆菌裂解物刺激单核细胞，同时设立空白对照。12小时后收集细胞上清通过酶联免疫吸附法测定IL-1β、IL-1Ra水平，同时裂解细胞提取总RNA，利用实时定量PCR技术测定IL1B、IL1RN基因相对表达量。通过方差分析比较不同证型肺结核患者IL-1β、IL-1Ra表达水平的差异。结果(1)成功建立检测IL1B、IL1RN基因的实时定量PCR技术，靶基因可以被有效扩增，并且引物具有良好特异性;(2)结核菌刺激后IL-1β蛋白表达水平显著升高，其中肺阴亏虚组显著高于阴虚火旺组和气阴两虚组(P<0.05)，阴虚火旺组IL-1β分泌水平又显著高于气阴两虚组(P<0.05)。IL-1B mRNA表达趋势与蛋白表达趋势一致，肺阴亏虚、阴虚火旺、气阴两虚三组中IL-1B基因表达水平依次降低，组与组之间差异均有统计学意义(P<0.05、P<0.01)；(3)结核菌刺激能够显著增加IL-1Ra分泌水平，气阴两虚组显著高于其它两组(P<0.05)，而肺阴亏虚组和阴虚火旺组差异无统计学意义(P>0.05)。同时，在mRNA层面气阴两虚组IL1RN表达水平显著高于其它两组，差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)；(4)在结核菌刺激后，IL-1β/IL-1Ra比值在肺阴亏虚和阴虚火旺组中明显增高，显著高于气阴两虚组(P<0.01、P<0.05)。 结论IL-1β、IL-1Ra表达水平与肺结核中医病机演变密切相关，由此推测它们不仅可以作为肺结核中医微观辨证的生物标识，也可以作为未来结核病治疗的有效分子靶点。

肺结核；中医证型；白介素-1β；白介素-1受体拮抗剂；单核细胞

结核病(tuberculosis，TB)是由单一感染因素引起的死亡率最高的疾病，因本病每年全球死亡人数高达140万，是严重危害人类健康的重大公共卫生问题。经过多年努力，中国结核病流行总体形势有所好转，但仍是结核病高负担国家之一，并且耐多药结核(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)的危害也日益凸显[1]。肺结核(pulmonary tuberculosis，PTB)是结核病的主要表现形式，属于中医“肺痨”范畴，其病因外为感染痨虫，内为正气虚弱，且两者相互为因。结核杆菌属于胞内菌，可以在CD14+细胞来源的巨噬细胞中复制、存活[2]。白介素-1β(interleukine-1β，IL-1β)作为巨噬细胞分泌的重要前炎症因子，在控制结核菌感染以及转归中扮演重要角色[3]。IL-1R拮抗剂(IL-1Ra)由IL1RN基因编码，能特异性地与IL-1受体结合，拮抗IL-1而发挥其生物学效应[4]。本研究通过探讨肺结核患者不同中医证型与CD14+单核细胞IL-1β、IL-1Ra表达水平的相关性，以期明确肺结核病机演变过程中免疫应答变化特征，并为中医微观辨证提供新的生物标识。

1　对象与方法

1.1研究对象

选取于2014年6月至2015年6月期间在深圳市第三人民医院就诊的104例肺结核患者为研究对象，其中男性65例，女性39例，平均年龄(36.5±13.7)岁。所有患者均符合2005年中华医学会《临床诊疗指南·结核病分册》中的诊断要求[5]，且痰涂片阳性，结核菌特异性IFN-γ Elispot检测阳性，均为初治肺结核，无合并其它感染性疾病、遗传代谢性疾病和自身免疫性疾病等。本研究经深圳市第三人民医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2试剂与仪器

人淋巴细胞分离液(批号：DKW-KLSH-0100)购自深圳达科微生物公司，RPMI 1640培养基(批号：11875-093)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，批号：10437-028)均购自美国Gibco公司，CD14免疫磁珠(货号130-097-052)购自德国Miltenyi公司，总RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit，批号：74106)购买自德国Qiagen公司，SYBR Green实时定量PCR试剂(批号：RR820A)购自日本TAKARA公司，qPCR引物委托深圳华大基因研究院合成，IL-1β、IL-1Ra细胞因子ELISA检测试剂盒(批号：DLB50、DRA00B)购自美国R&D公司。CO2细胞培养箱为美国Thermo Fisher公司产品，多功能酶标仪DTX880和细胞离心机为德国Beckman公司产品，ABI 7500实时定量PCR仪购自美国ABI公司，结核分枝杆菌裂解物由课题组前期自行制备并保存。

1.3中医诊断标准

依据国家中医药管理局《中医病证诊断疗效标准》[6]，拟定肺阴亏虚、阴虚火旺、气阴两虚3个证型的主症和次症，根据其临床证侯、舌象、脉象进行中医辨证分型。所有病例的辨证分型均由两名专科中医师共同完成，分型结果不一致的病例予以剔除。由于阴阳两虚多见于病程日久、迁延难愈患者，且合并艾滋病患者居多，为避免不同疾病中医证型的相互干扰，本研究未纳入阴阳两虚患者。入选病例中肺阴亏虚33例、阴虚火旺36例、气阴两虚35例。不同中医证型人群在年龄、性别分布中差异无统计学意义(P>0.05)。

1.4外周血CD14+单核细胞的分选

用肝素锂抗凝管采集外周血5 mL，然后使用磷酸盐缓冲液(PBS)对比稀释，缓慢加入Ficoll淋巴细胞分离液上方，采用密度离心法分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，取1×107个PBMCs与CD14免疫磁珠5 μL置于4℃保存，孵育20分钟，再使用MACS自动磁珠分选仪获得CD14+单核细胞。

1.5结核杆菌刺激CD14+单核细胞

将来源于同一结核病患者的CD14+单核细胞一分为二，分别接种在24孔细胞培养板中两个细胞孔，细胞密度为2×105个/孔，加入含10 %胎牛血清的RPMI 1640培养基，并放置在5% CO2、37°C培养箱中孵育培养，12小时后，将其中一个细胞孔加入经煮沸处理的结核菌裂解物(Mtb lysate，20 μg/mL)刺激。刺激12后分别收集细胞和培养上清，细胞裂解后提取总RNA，上清检测炎症因子IL-1β、IL-1Ra浓度。另外一个细胞孔则以无细菌刺激作为空白对照。

1.6总RNA的提取及实时定量PCR检测

根据RNeasy Mini Kit的说明书操作步骤，从CD14+单核细胞中提取总RNA。RNA的质量及浓度检测采用超微量分光光度计测定。取2 μL RNA，使用oligo-T通用逆转录引物，在逆转录酶的作用下生成cDNA。使用IL1B和IL1RN基因特异性引物进行qPCR反应，引物序列见表1，反应体系如下：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL， cDNA模板2 μL，加双蒸水至20 μL。反应条件：95°C 30秒，随后95°C 5秒，60°C 34秒，共40个循环。通过甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内参基因Ct值进行标准化，最终以2-ΔΔCt值表示IL1B和IL1RN基因拷贝数。

1.7ELISA测定细胞上清IL-1β、IL-1Ra浓度

ELISA试剂盒测定IL-1β、IL-1Ra浓度。首先加入200 μL样本至反应孔中，室温孵育2小时后，PBS洗涤3次，然后加入200 μL酶标二抗室温孵育1小时，PBS洗涤3次，最后加入200 μL底物显色，使用DTX880酶标仪读取光密度值(optical density，OD)，根据标准曲线计算炎症因子浓度，然后比较不同中医证型患者之间表达水平差异。

1.8统计学处理

2　结果

2.1应用实时定量PCR技术检测IL1B、IL1RN基因表达

如图1所示，qPCR扩增曲线图显示IL1B、IL1RN和GAPDH基因可以被有效扩增，而熔解曲线图显示不同基因具有特异性熔解曲线，而且曲线峰值单一，提示前期设计的引物具有很好的敏感性和特异性。

2.2不同中医证型肺结核患者CD14+单核细胞IL-1β表达水平差异

相对于空白对照，结核菌裂解物能显著刺激IL-1β分泌，其中肺阴亏虚组表达水平最高，显著高于阴虚火旺组和气阴两虚组，差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)，其中阴虚火旺组IL-1β分泌水平又显著高于气阴两虚组(P<0.05)。同时利用qPCR技术检测IL1B基因表达水平，与蛋白表达水平相一致，在肺阴亏虚、阴虚火旺、气阴两虚三组中IL1B基因表达水平依次降低，且组间比较差异均有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。详见表2。

图1　应用实时定量PCR技术检测IL1B、IL1RN基因表达

表2　不同中医证型肺结核患者CD14+单核细胞IL-1β及其mRNA表达水平比较

注： 与空白对照孔相比，aP<0.01 ；与肺阴亏虚组相比，bP<0.01；与阴虚火旺组相比，cP<0.05。

2.3不同中医证型肺结核患者CD14+单核细胞IL-1Ra表达水平差异

在无结核菌刺激的条件下，IL-1Ra分泌水平在肺阴亏虚、阴虚火旺、气阴两虚三组患者中差异无统计学意义(P>0.05)，而结核菌刺激能够显著增加IL-1Ra分泌水平，其中气阴两虚组升高最为明显，显著高于肺阴亏虚组和阴虚火旺组，差异有统计学意义(P<0.05)，而肺阴亏虚组和阴虚火旺组差异无统计学意义(P>0.05)。IL-1Ra的编码基因为IL1RN，在mRNA水平，气阴两虚组IL1RN表达水平显著高于其他两组，差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。详见表3。

表3　不同中医证型肺结核患者CD14+单核细胞IL-1Ra及其mRNA表达水平比较

注： 与空白对照孔相比，aP<0.01 ；与肺阴亏虚组相比，bP<0.05；与阴虚火旺组相比，cP<0.01。

2.4肺结核患者中医证型与CD14+单核细胞IL-1β/IL-1Ra比值的相关性

根据上述细胞上清IL-1β和IL-1Ra浓度进一步计算IL-1β/IL-1Ra比值，如表4所示，与空白对照组比较，肺阴亏虚、阴虚火旺、气阴两虚三组IL-1β/IL-1Ra比值差异无统计学意义(P>0.05)，而在结核菌刺激后，IL-1β/IL-1Ra比值在肺阴亏虚和阴虚火旺中显著增高，显著高于气阴两虚组，差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。详见表4。

表4　肺结核患者中医证型与CD14+单核细胞上清中IL-1β/IL-1Ra比值的相关性

注： 与空白对照孔相比，aP<0.01 ；与肺阴亏虚组相比，bP<0.01；与阴虚火旺组相比，cP<0.05。

3　讨论

中医学对“肺痨”的认识历史悠久，早在《内经·灵枢》就有记载“咳，脱形，身热，脉小以疾”，详细描述了肺痨的主症和慢性消耗性特征。晋代《肘后备急方》首次创立“鬼注”“尸注”之名，并认识到本病具有传染性。宋代《三因极一病证方论》首次提出“痨瘵”之名，并与“虚劳”病证划清界限。《普济本事方》记载“肺虫居肺叶之内，蚀人肺体，故成瘥疾，咯血声嘶”，认为本病是由“肺虫”引起。《医学正传·劳极》确立了杀虫与补虚两大治疗原则。肺痨病位在肺，肺喜润恶燥，痨虫蚀肺，首耗肺阴，阴不制阳，则现阴虚火旺之候，若阴伤及气，或阴损及阳，则可出现气阴两伤或阴阳两虚之候[7]。因此朱丹溪提出“痨瘵主乎阴虚”之说，并倡导“滋阴降火”这一治则应贯穿肺痨治疗的始终。

多种微生物感染可以诱导IL-1β产生，如《Nature》报道[8]白色念珠菌通过激活NLRP3炎症小体而促进IL-1β产生并介导宿主抗真菌免疫应答。Mishra等[9]发现结核杆菌效应分子ESAT-6同样能够被NLRP3炎症小体识别并导致IL-1β分泌。动物实验证实IL1B基因敲除小鼠在感染结核菌后表现出更高的死亡率和肺脏细菌载量[10]，提示IL-1β及其介导的信号通路在结核保护性免疫中发挥重要作用。IL-1Ra是一种有高度选择性的竞争性受体拮抗剂，它与受体结合但并不能激活受体，从而抑制IL-1β的多种生物学活性[4]。IL-1β/IL-1Ra比值可以作为评估机体抗结核免疫应答的重要指标。

在本研究中，结核菌刺激能够显著诱导CD14+单核细胞分泌IL-1β和IL-1Ra，而以肺阴亏虚患者IL-1β表达水平最高，随着病机演变，阴虚火旺患者逐渐降低，至气阴两伤阶段，其表达水平最低，提示IL-1β表达水平与病机演变密切相关，而且IL-1β作为机体抗结核感染免疫的重要指标，也可以作为中医正气损伤的有效生物标识。此外，研究发现气阴两虚患者IL-Ra表达水平显著升高，因此推测对于肺痨后期患者，IL-Ra升高竞争性抑制IL-1β介导的抗结核免疫应答，从而导致病情迁延难愈。IL-Ra不仅可以作为气阴两虚证型的微观辨证标签，也有希望作为未来结核病治疗的分子靶点。

总而言之，本研究证实在肺结核早期(肺阴亏虚型)，主要表现为高IL-1β、低IL-Ra表达；在疾病中期(阴虚火旺型)，IL-1β水平逐渐降低；而在疾病后期(气阴两虚型)，则呈现低IL-1β、高IL-Ra的临床表型。以上结果提示在肺结核病机演变过程中，IL-1β介导的宿主保护性免疫逐渐弱化，而IL-Ra介导的病理性免疫逐渐增强。根据本研究结果，在未来结核病治疗中，需要在中医辨证施治的基础上，适当配伍合适的免疫调节剂，如黄芪多糖和黄芪皂苷已被证实可以促进巨噬细胞分泌IL-1β[11]，这是未来研究的主要方向。

[1]Chiang CY，Van Weezenbeek C，Mori T，et al. Challenges to the global control of tuberculosis [J]. Respirology，2013，18(4)：596-604.

[2]Monack DM，Mueller A，Falkow S. Persistent bacterial infections：the interface of the pathogen and the host immune system [J]. Nat Rev Microbiol，2004，2(9)：747-765.

[3]Jayaraman P，Sada-Ovalle I，Nishimura T，et al. IL-1β promotes antimicrobial immunity in macrophages by regulating TNFR signaling and caspase-3 activation [J]. J Immunol，2013，190(8)：4196-204.

[5]中华医学会. 临床诊疗指南·结核病分册[M].北京：人民卫生出版社，2005：7-9.

[6]国家中医药管理局. 中医病证诊断疗效标准[M].南京：南京大学出版社，1994：3.

[7]王梅，陈红兵，王波，等. 肺结核合并支气管结核中医证候分布规律初探 [J]. 中医中药，2013，10(26)：116-118.

[8]Gross O，Poeck H，Bscheider M，et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence [J]. Nature，2009，459(7245)：433-436.

[9]Mishra BB，Moura-Alves P，Sonawane A，et al. Mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6 is a potent activator of the NLRP3/ASC inflammasome [J]. Cell Microbiol，2010，12(8)：1046-1063.

[10]Mayer-Barber KD，Andrade BB，Barber DL，et al. Innate and adaptive interferons suppress IL-1α and IL-1β production by distinct pulmonary myeloid subsets during Mycobacterium tuberculosis infection [J]. Immunity，2011，35(6)：1023-1034.

[11]陈丹，刘光陵，吴雪琼. 具有抗结核作用中药及其成分研究进展 [J]. 辽宁中医药大学学报，2015，17(1)：128-131.

(本文编辑： 韩虹娟)

Discrepancy between IL-1β and IL-1Ra expression in CD14+monocytes of different TCM syndrome types of pulmonary tuberculosis patients

ZHANGGuo-liang，WANGLing-ling，ZHANSen-lin，etal.

InstituteofHepatology，ShenzhenThirdPeople’sHospital，Shenzhen518112，China.

ZHANGGuo-liang，E-mail：szdsyy@aliyun.com

ObjectiveTo explore the discrepancy between IL-1β and IL-1Ra expression in CD14+ monocytes of different TCM syndrome types of pulmonary tuberculosis patients. MethodsTotally 104 pulmonary tuberculosis patients were recruited，the patients were divided into Lung-Yin deficiency(n=33)，Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity(n=36)，and Qi and Yin deficiency(n=35). The density gradient centrifugation was used to separate PBMCs from peripheral blood，then CD14+ monocytes were purified after incubation with magnetic beads. Monocytes were stimulated with or without Mtb lysate for 12 hours，the supernatant was collected to detect IL-1β and IL-1Ra levels using ELISA，and total RNA was purified from cells and gene expression of IL1B and IL1RN was determined with real-time qPCR assay. Finally，the discrepancy was compared with ANOVA analysis. Results(1)The expression of IL1B and IL1RN could be detected by real-time quantitative PCR assay with gene specific primers. (2)After Mtb stimulation，IL-1β level was the highest in Lung-Yin deficiency group compared to Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity group and Qi and Yin deficiency group(P<0.05、P<0.01), and it was higher in Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity group than that in Qi and Yin deficiency group(P<0.05). There was similar pattern observed in IL1B mRNA level, and IL1B level decreased in the order of Lung-Yin deficiency, Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity, and Qi and Yin deficiency(P<0.05、0.01). (3)IL-1 Ra expression increased significantly after Mtb stimulation, it was the highest in Qi and Yin deficiency group compared to other two groups(P<0.05), and there was no difference between Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity group and Qi and Yin deficiency group(P>0.05). Similar pattern was also observed in IL1RN level，which Qi and Yin deficiency group had the highest level(P<0.05,P<0.01). (4)After Mtb stimulation，IL-1β/IL-1Ra ratio increased in Lung-Yin deficiency and Yin-Deficiency and Fire-Hyperactivity groups，which was higher than that in Qi and Yin deficiency(P<0.01,P<0.05). ConclusionExpression of IL-1β and IL-1Ra was associated with TCM pathogenesis evolution of pulmonary TB patients，which could be considered as biomarkers of microcosmic syndrome differentiation and effectively therapeutic targets.

Pulmonary tuberculosis；TCM syndrome types；Interleukine-1β；Interleukine-1 receptor antagonist；Monocytes

国家自然科学基金(81501714)；广东省自然科学基金(2014A030313789)；深圳市科技计划项目(JCYJ20140411111718166)

518112深圳市第三人民医院肝病研究所(张国良、詹森林、汪文斐、聂广)，结核病科(王玲玲、曹廷智、张红梅、邓群益)

张国良(1982- )，博士，副主任医师。研究方向：感染病中西医结合诊治研究。E-mail：szdsyy@aliyun.com

R249

Adoi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.10.003

2016-07-04)