六味地黄胶囊的质量标准研究

苌玲+茅向军

【摘要】目的：建立六味地黄胶囊中酒萸肉的薄层色谱鉴别及莫诺苷和马钱苷的总量与丹皮酚含量的测定方法。方法：采用薄层色谱法对六味地黄胶囊中酒萸肉进行定性鉴别，采用高效液相色谱法同时测定方中酒萸肉里莫诺苷和马钱苷的总量及牡丹皮中丹皮酚的含量；色谱柱为Thermo-C18（4.6×250mm，5μm），流动相：以乙腈为流动相A，以0.3%磷酸为流动相B，采用梯度洗脱，流速1mL/min，柱温35℃，马钱苷和莫诺苷的检测波长为240nm，丹皮酚的检测波长为270nm。结果：薄层色谱鉴别斑点清晰，阴性对照无干扰；莫诺苷在0.03508～1.0524μg范围中线性关系良好，平均回收率为100.41%，RSD为1.21%（n=6）；马钱苷在0.049342～1.480262μg范围中线性关系良好，平均回收率为101.91%，RSD为1.37%（n=6）；丹皮酚在0.17046～5.1138μg范围中线性关系良好。平均回收率为103.54%，RSD为0.92%（n=6）。结论：所建立的方法简便、准确、重复性好，可用于六味地黄胶囊中酒萸肉的鉴别和酒萸肉里莫诺苷和马钱苷的总量及牡丹皮中丹皮酚的含量测定。

【关键词】 六味地黄胶囊；酒萸肉；莫诺苷；马钱苷；丹皮酚

【中图分类号】R284 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）16-0029-04

Abstract：Objective to establish a method for the determination of Liuwei Dihuang capsule in Fructus Corni by TLC and morroniside and loganin total quantity and the content of paeonol. Methods the TLC method of Liuwei Dihuang capsule in Fructus Corni were identified， by high performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of party in Fructus Corni in morroniside and loganin content and cortex moutan in paeonol content； column chromatography Thermo-C18 （4.6×250mm，5μ）， flow phase： with acetonitrile as mobile phase a， with 0.3% phosphoric acid as the mobile phase B， the gradient elution， flow rate of 1mL / min， column temperature 35 degrees Celsius， detection wavelength of loganin and morroniside was 240nm， paeonol detection wavelength 270nm. Results TLC spots were clear， without the interference of negative control； morroniside in 0.03508～1.0524 μg range linear relationship is good. The average recovery rate was 100.41%， RSD = 1.21% （n = 6）； loganin in 0.049342 ～1.480262 μg range linear relationship is good. The average recovery rate was 101.91%， RSD was 1.37% （n = 6）； paeonol in 0.17046～5.1138 μg range linear relationship good. the average recovery was 103.54%， RSD was 0.92% （n=6）. Conclusion the established method is simple， accurate and with good reproducibility and can be used for the determination of the content of morroniside and loganin total and tree peony bark of Paeonol in Liuweidihuang capsule liquor Cornus and the identification of Fructus Corni.

Keywords： Six Dihuang Capsules； Fructus Corni； Monod Glycosides； Loganin； Paeono

六味地黄胶囊收载于《中国药典》2015年版一部，原标准有茯苓的显微鉴别以及丹皮酚、山茱萸和熊果酸、泽泻、茯苓的薄层色谱鉴别；含量测定采用薄层扫描法测定了酒萸肉中熊果酸的含量，采用HPLC法测定牡丹皮中丹皮酚的含量。2015 版《中国药典》一部收载六味地黄的4种制剂，只有胶囊剂在含量测定中测定熊果酸，其余均为测定马钱苷。酒萸肉药材的定量指标为马钱苷，其制剂则为熊果酸，而熊果酸含量在药材检测中没有体现，难以保证制成胶囊后的含量一定符合规定，故将六味地黄胶囊山茱萸和熊果酸的薄层色谱鉴别改为酒萸肉中莫诺苷和马钱苷的薄层色谱鉴别，含量测定更改为高效液相色谱法同时测定酒萸肉中莫诺苷和马钱苷的总量及牡丹皮中丹皮酚的含量，使质量标准更完善，检验方法更简便。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters2695-2998高效液相色谱仪、配套自动进样系统及配套工作站；超声波清洗器（北京医疗设备厂）；梅特勒XS205电子天平；梅特勒MS105DU电子天平。

1.2 材料 莫诺苷（批号：201304）、马钱苷（批号：111640-201005）和丹皮酚（批号：110708-200506）购自中国药品生物制品检定所。薄层色谱硅胶G（青岛海洋化工有限公司）。乙腈为Tedia Company色谱纯、水为超纯水，其他试剂为天津富宇精细化工有限公司的分析纯。样品由厂家提供，阴性样品自制。

2 方法与结果

2.1 酒萸肉的薄层色谱鉴别 取本品内容物2g[规格（1）]或4g[规格（2）]，加甲醇50mL回流30min，放冷，滤过，蒸干，残渣加水5mL使溶解，过D101大孔树脂柱（3g，100目，直径1.5cm），先用水洗脱至无色，弃去，再依次用10%和30%乙醇各50mL洗脱，合并，蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，作为供试品溶液；取莫诺苷对照品和马钱苷对照品分别加甲醇制成1mg/mL的对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述两种溶液各2-5μl，分别以条状斑点点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点和荧光斑点。结果表明，分离度好，斑点显色清晰，阴性无干扰。见图1。

2.2 六味地黄胶囊的含量测定

2.2.1 对照品、供试品以及阴性对照溶液的制备 分别精密称取莫诺苷、马钱苷、丹皮酚对照品适量，加甲醇制成每1mL含莫诺苷0.03mg，马钱苷0.04mg、丹皮酚0.15mg的混合溶液，即得对照品溶液。取本品1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，密塞，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。取自制阴性样品按“2.2.1”项供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.2.2 色谱条件 色谱柱：Thermo-C18（4.6×250mm，5μm）；以乙腈为流动相A，以0.3%磷酸为流动相B，按照表1梯度洗脱；柱温：35℃；马钱苷和莫诺苷的检测波长为240nm，丹皮酚的检测波长为270nm；理论塔板数按马钱苷计算均应不低于3000。

2.2.3 系统适用性试验 取对照品、供试品和阴性对照溶液各注入10μL液相色谱仪，按上述色谱条件测定，比较色谱图。实验结果表明供试品中莫诺苷、马钱苷和丹皮酚峰与对照品色谱峰分别对应一致，并且阴性无干扰。本法测定其含量专属性强、灵敏度高、重现性好。见图2。

2.2.4 线性关系考察 莫诺苷对照溶液：0.03508mg/mL，马钱苷对照溶液：0.049342mg/mL，丹皮酚对照溶液：0.17046mg/mL，进样体积为1μL，2μL，5μL，10μL，16μL，20μL，25μL，30μL。 按上述色谱条件测定对照品峰面积，以峰面积为纵坐标，莫诺苷、马钱苷和丹皮酚的浓度为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程，莫诺苷：y=1661478.1729x-11844.7899，r=0.99997；马钱苷：y=1544769.4643x-29732.7619，r=0.99992；丹皮酚：y=4594662.9994x+241386.0272，r=0.99984。结果表明莫诺苷在0.03508～1.0524μg范围中线性关系良好；马钱苷在0.049342～1.480262μg范围中线性关系良好；丹皮酚在0.17046～5.1138μg范围中线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 取对照品溶液 10μL，连续进样6次。结果显示供试品溶液中莫诺苷峰面积的RSD为0.63%；马钱苷峰面积的RSD为0.93%；丹皮酚峰面积的RSD为0.34%。表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取同一供试品（20140101，企业G），按供试品制备方法制备，按上述色谱条件测定莫诺苷、马钱苷和丹皮酚的含量，莫诺苷含量测定平均值为1.7174mg/g，RSD为0.74%；马钱苷含量测定平均值为1.3944mg/g，RSD为1.65%；丹皮酚含量测定平均值为5.7767mg/g，RSD为1.04%。结果表明本方法重复性良好。

2.2.7 加样回收率试验 精密称取供试品6份（供试品莫诺苷含量为1.7174mg/g、马钱苷含量为1.3944mg/g、丹皮酚含量为5.7767mg/g），分别精密加入含0.0235mg/mL的莫诺苷对照、0.02599mg/mL的马钱苷对照和0.05924mg/mL丹皮酚对照的混合溶液50mL，按供试品溶液制备方法处理，同法测定。结果表明本方法回收率较好。结果见表2、表3及表4。

2.2.8 稳定性试验 取同一供试品（20140101，企业G），按供试品制备方法制备，按上述色谱条件测定莫诺苷、马钱苷和丹皮酚的含量，分别于0、2、4、6、8、10h进样一次，莫诺苷峰面积RSD为0.53%，马钱苷峰面积RSD为0.84%，丹皮酚峰面积RSD为0.46%。表明供试品溶液在10h内稳定。

2.2.9 样品测定 根据上述条件，测定了规格（1）4批样品，规格（2）18批样品，结果见表5。

3 讨论

对薄层鉴别方法样品的前处理，曾采用甲醇回流提取后蒸干残渣溶解直接点样，但未取得较好的鉴别效果，最后采用甲醇回流提取后蒸干，残渣加水溶解过d101大孔树脂的方法制备样品进行鉴别，结果表明，分离度好，Rf值达到要求，重现性好，阴性无干扰，经多批次试验，均能较好重现。

对提取方法采用加热回流30min与超声30min比较，结果表明回流方法优于超声方法。

对提取时间考察，分别加热回流30min与1h，结果表明回流1h有效成分提取完全，故选择回流1h。

分别对50%甲醇、甲醇、乙醇进行了比较。结果表明，甲醇和乙醇提取的供试品在与对照品色谱相应的位置上提取不到莫诺苷和马钱苷的色谱峰或者峰形很差，50%甲醇的提取效果和提取率优于其他溶剂。

分别对50%甲醇各25mL、50mL进行了试验，结果表明50%的甲醇50mL提取得更加完全，故选择50%的甲醇50mL。

检测波长经查阅资料，并对莫诺苷、马钱苷和丹皮酚进行光谱扫描后，定为莫诺苷和马钱苷的检测波长为240nm，丹皮酚的检测波长为274nm。

本方法比较原有方法专属性更强，采用双波长，提取和检验都缩短了时间，提高了检验效率。本试验在原标准的基础上经研究，将六味地黄胶囊山茱萸和熊果酸的薄层色谱鉴别改为酒萸肉中莫诺苷和马钱苷的薄层色谱鉴别，含量测定更改为高效液相色谱法同时测定酒萸肉中莫诺苷和马钱苷的总量及牡丹皮中丹皮酚的含量，专属性更强，提高了检验效率，同时使质控标准更趋完善，更有效控制了六味地黄胶囊的质量。

参考文献

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（编辑：陶希睿）