酶-超声辅助提取苦荞秆中总黄酮及抗氧化活性研究

杨海涛，曹小燕*

（1.陕西理工大学 陕西省催化基础与应用重点实验室，陕西 汉中 723000；2.陕西理工大学 化学与环境科学学院，陕西 汉中 723000）

酶-超声辅助提取苦荞秆中总黄酮及抗氧化活性研究

杨海涛，曹小燕*

（1.陕西理工大学 陕西省催化基础与应用重点实验室，陕西 汉中 723000；2.陕西理工大学 化学与环境科学学院，陕西 汉中 723000）

以秦巴山区苦荞秆为原料，通过单因素结合正交试验研究了纤维素酶-超声辅助提取苦荞秆中总黄酮的工艺条件，并考察其对羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS自由基正离子的清除活性及还原能力。结果表明，苦荞杆总黄酮的最佳提取工艺为：纤维素酶10 mg/g，乙醇体积分数40%，超声温度40℃，超声时间30 min，料液比为1∶40（g∶mL），该条件下总黄酮的得率为2.30%，苦荞秆总黄酮对羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS自由基正离子的半抑制浓度IC50值分别为0.18 mg/mL、0.24 mg/mL和2.24 μg/mL，强于同浓度条件下天然抗氧化剂维生素C。

苦荞秆；黄酮；纤维素酶；超声提取；抗氧化活性

苦荞属双子叶蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum）植物，又名春荞、野荞麦，学名鞑靼荞麦（F.tataricum），原产于我国东北和西南部四川凉山地区［1］，是自然界中较少的药食两用作物［2］。大量研究表明苦荞具有较高的营养价值，其中维生素B2的含量是大米和小麦的3～11倍，蛋白质、脂肪和钾、镁、铁等矿物元素含量均明显高于大米和小麦。苦荞富含芦丁、叶绿素、槲皮素、桑色素、莰菲醇、金丝桃苷、白藜芦醇等［3］，具有降低血糖、血脂和尿糖的“三降”作用，对糖尿病、脑血管硬化、高血脂、心血管疾病具有预防和治疗的作用。

目前，苦荞的研究多涉及种子、芽、叶、麸皮和壳中黄酮提取工艺的优化、组分鉴别及其抗氧化活性［4］。苦荞秸秆资源丰富，实验证明其含有黄酮类物质，如刘红等［5］借助微波辅助技术优化了苦荞秸秆中总黄酮的提取工艺，在最佳工艺条件下总黄酮的提取率为1.53%；王敏等［6］结合纤维素酶法优化了水提黄酮的提取工艺，优化后的总黄酮提取率为1.47%，是未经酶解提取率的3.08倍。酶法结合超声波的空化作用、机械效应、凝聚效应，能够有效地提高总黄酮的溶出效率。本研究采用秦巴苦荞秆为试验原料，以总黄酮的提取率为评价指标，纤维素酶结合超声波辅助醇提法提取苦荞秆中的总黄酮，并对其抗氧化性进行评价，为苦荞秆资源在饲料工业中的进一步开发利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

苦荞秆：采摘于陕西省镇巴县，50℃烘干，粉碎，过80目筛备用；芦丁标准品（纯度≥98%）：中国药品生物制品检定所；纤维素酶（10 000 U/g）、邻二氮菲、邻苯三酚、2，2-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）、维生素C、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、无水乙醇、亚硝酸钠（均为分析纯）：阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2仪器与设备

AL204-IC型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Cary50紫外可见分光光度计：美国瓦里安公司；SB-4200DTD型超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；JXL-2S-6A数显恒温水浴锅：江苏省金坛市金祥龙电子有限公司；101A-1电热鼓风干燥箱：重庆银河试验仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式真空泵：郑州长城科工贸有限公司；800型离心机：上海手术器械厂。

1.3试验方法

1.3.1芦丁标准曲线的绘制

依据NaNO2-Al（NO3）3比色法，于波长510nm处测定吸光度值［7］，以芦丁标准品质量浓度（C，mg/mL）为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线，所得线性回归方程为：A=10.183C-0.001 2，相关系数R2=0.999 8。

1.3.2苦荞杆黄酮的提取及含量的测定

准确称取1.0000 g苦荞秆粉置于50 mL圆底烧瓶中，加入不同体积分数的乙醇溶液，再加缓冲溶液调节pH值，50℃恒温水浴酶解1 h，酶解完全后转移至超声波清洗机中设定功率为250W提取，真空泵抽滤，2 000 r/min离心5 min。取一定体积离心液于50mL容量瓶中，依据NaNO2/Al（NO3）3比色法在波长510 nm处测定苦荞杆黄酮的吸光度值，根据回归方程计算提取液中总黄酮的含量C，由下式计算超声辅助提取苦荞秆总黄酮的提取率：

式中：V为样品液体积，mL；C为苦荞秆总黄酮提取液质量浓度，mg/mL；N为提取液稀释倍数，M为称取的苦荞秆粉末质量，g。

1.3.3单因素试验

选取影响酶法-超声辅助提取苦荞秆中总黄酮提取率的6个因素，考察各个因素对苦荞秆中总黄酮提取率的影响。考察单个因素对总黄酮提取率的影响时，分别改变所对应的设定因素，固定pH值为6，超声功率为250 W。纤维素酶用量设定水平分别为：4 mg/g、6 mg/g、8 mg/g、10mg/g、12mg/g；乙醇体积分数的设定水平为：20%、30%、40%、50%、60%；料液比的设定水平为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL）；超声温度设定水平为：20℃、30℃、40℃、50℃、60℃；超声时间设定为10min、20min、30min、40min、50min。

1.3.4正交试验

依据单因素试验结果，精确称取1.000 0 g的苦荞秆粉末，设定超声波功率250 W，调节缓冲溶液pH值为6，以纤维素酶量、乙醇体积分数、料液比、超声温度和超声时间为正交试验的5个影响因子，通过L16（45）正交试验优化苦荞秆中总黄酮的提取工艺，具体因素与水平见表1。

表1　总黄酮提取条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for total flavonoids extraction conditions optimization

1.3.5苦荞杆总黄酮的抗氧化性研究

依据Oyaizu法［8］评价苦荞杆总黄酮的还原能力，邻苯三酚自氧化体系［9］评价苦荞杆总黄酮清除超氧阴离子自由基能力，邻二氮菲-Fe2+氧化体系［10］评价苦荞杆总黄酮清除羟自由基活性，过硫酸钾氧化ABTS法［11］评价苦荞杆总黄酮清除ABTS+·能力。各自由基的清除公式如下：

式中：A0为自由基溶液的吸光度值；A样品为测定样品的吸光度值；A1为测定黄酮溶液自身的吸光度值；A损伤为只加自由基溶液的吸光度值；A未损为不加入样品和过氧化氢溶液的吸光度值。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1纤维素酶量对苦荞杆总黄酮提取率的影响

纤维素酶能够有效破坏苦荞杆的纤维素，促使总黄酮的溶出［12］。纤维素酶量对总黄酮提取率的影响结果见图1。

图1　纤维素酶量对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of cellulase dosage on total flavonoids extraction rate

由图1可知，随着纤维素酶用量的增加，易于苦荞杆细胞壁的破碎，总黄酮的提取率逐渐增加，酶添加量为10 mg/g时，总黄酮提取率最大，进一步增加纤维素酶，提取率反而有所降低。可能的原因是随着纤维素酶量的增加，总黄酮的溶出率逐渐增加，但是过多的酶具有黏附性能，阻塞黄酮的溶出通道，因此其提取率有所下降，故最佳的纤维素酶添加量为10 mg/g。

2.1.2乙醇体积分数对苦荞杆总黄酮提取率的影响

乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响结果见图2。由图2可知，伴随乙醇体积分数的增大，总黄酮提取率的趋势是先增大后减小。乙醇体积分数为20%～30%，提取率逐渐增大，这是因为苦荞秆总黄酮的溶出随乙醇体积分数的升高而增大，当乙醇体积分数达到30%时，提取率达到最大值，说明在该试验条件下苦荞秆总黄酮的浸出达到最大值；乙醇体积分数超过30%后，即使继续增加乙醇体积分数，总黄酮的浸出却逐步降低，可能是浓度过大，一些易溶于醇的物质与黄酮竞争性地浸出，从而致使总黄酮的提取率降低。故最佳的乙醇体积分数为30%。

图2　乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on total flavonoids extraction rate

2.1.3超声温度对苦荞杆总黄酮提取率的影响

图3　超声温度对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on total flavonoids extraction rate

超声温度对总黄酮提取率的影响结果见图3。由图3可知，苦荞秆中总黄酮的提取率随温度的升高而增加，可能是超声波的空化作用促使植物细胞壁破裂，总黄酮的溶出效果增加，30℃时达到峰值，之后随温度的增加提取率的增加较为缓慢，这可能是升高温度促使浸提液黏度降低，黄酮在乙醇中的溶解度增大，使黄酮类化合物的提取率也随着温度的升高而增大，综合考虑苦荞秆中总黄酮的超声温度宜选取30℃。

2.1.4超声时间对苦荞杆总黄酮提取率的影响

图4　超声时间对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on total flavonoids extraction rate

由图4可知，随着超声时间的加长，提取率先增大后减小。在30 min以前，随着时间延长，提取率也大幅度增大，因为随着提取时间的增加总黄酮在乙醇溶液中逐渐溶出；当超声时间达到30 min时提取率达到峰值，随后提取率反而缓慢降低，这可能是由于超声时间加长，溶液黏度增大的同时增大传质阻力，对黄酮的溶出产生了影响；此外超声波的空化效应和机械效应，可能引起黄酮类分解，因此，选择超声时间30 min为宜。

2.1.5料液比对苦荞杆总黄酮提取率的影响

图5　料液比对总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on total flavonoids extraction rate

料液比对总黄酮提取率的影响见图6。由图6可知，随着液料比的增大，苦荞杆中总黄酮的提取率是先增加后降低最后趋于平缓，其原因是随着液料比的增加，超声波在液体中能够达到有效的搅动和流动，在1∶30（g∶mL）时达到峰值。随着液体的进一步增加，样品中的有效浓度逐渐降低，超声波对溶液中微粒样品的凝聚作用相对减弱，提取率逐渐下降。进一步延长提取时间，提取效果趋于平缓。综合后续处理因素，料液比选择1∶30（g∶mL）为宜。

2.2正交试验结果与分析

依据单因素试验结果，固定超声波功率250 W，柠檬酸钠缓冲溶液的pH值6，选取纤维素酶量、乙醇体积分数、超声温度、超声时间和料液比为评价因素，采用L16（45）正交试验，试验结果见表2。

表2　总黄酮提取条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for total flavonoids extraction conditions optimization

由表2可知，对苦荞秆中总黄酮提取率的影响因素主次顺序为乙醇体积分数＞超声时间＞纤维素酶＞料液比＞提取温度，最佳提取条件为A3B3C3D2E3，即纤维素酶10 mg/g，乙醇体积分数40%，超声温度为40℃，超声时间30 min，料液比为1∶40（g∶mL）。

2.3验证试验

对最佳提取工艺进行3次平行试验验证，结果得到苦荞秆总黄酮的平均得率为2.30%。以不加纤维素酶最优条件下平行试验得到苦荞杆黄酮的得率仅为1.55%，可见酶法的提取效果明显高于传统提法，为以后秸秆资源的综合利用开发提供依据。

2.4苦荞秆总黄酮的抗氧化活性研究

2.4.1清除羟自由基（·OH）

图6　苦荞秆黄酮和VC对羟基自由基的清除活性Fig.6 Scavenging activity ofFagopyrum tataricumstraw flavonoids and vitamin C on·OH

由图6可知，随着样品浓度升高，苦荞秆总黄酮对·OH的清除活性逐渐增强且存在明显的量效关系［14］。当质量浓度为0.28mg/mL时，苦荞秆黄酮对·OH的清除率为96.35%，其清除半抑制浓度（50%inhibitory concentration，IC50）值为0.18 mg/mL；而相同质量浓度下的VC对·OH的清除率为58.73%，说明苦荞秆总黄酮对·OH具有一定的清除效果，其清除效果较优于VC溶液。

超氧阴离子自由基由氧分子结合一个电子构成，通过在生物体内长期攻击靶向目标，破坏细胞DNA，导致细胞内脂或蛋白氧化损伤，诱发氧化应激，继而导致各种肿瘤、动脉粥样硬化及中枢神经系统疾病等［15］。由图7可知，随苦荞秆总黄酮质量浓度升高，其对清除活性增强，并表现为良好的剂量关系。当苦荞秆总黄酮质量浓度为0.28 mg/mL时，苦荞秆总黄酮对的清除率为62.85%，其清除IC50值为0.24 mg/mL；而相同浓度条件下的VC溶液清除率仅为25.32%。结果表明，苦荞秆总黄酮对超氧阴离子自由基的清除效果强于同浓度条件下的VC溶液。

图7　苦荞秆黄酮和VC对清除活性Fig.7 Scavenging activity ofFagopyrum tataricumstraw flavonoids and vitamin C on

2.4.3清除ABTS自由基正离子（ABTS+·）

ABTS+·是一个相对稳定的自由基正离子，常用于评价抗氧化溶液的总抗氧化能力［16］。本试验以苦荞秆总黄酮提取液为反应液，随着样品质量浓度的升高，其对ABTS+·清除率逐渐增大，并且呈现出良好的量效关系。当加入苦荞提取液2.76 μg/mL时，其对ABTS+·清除率为75.41%，其清除IC50值为2.24 μg/mL；配制相同浓度的VC为参照，当加入常规抗氧化剂VC 0.46 μg/mL时，对ABTS+·清除率小于5%，随着样品质量浓度升高，清除活性缓慢增强，当质量浓度为2.76 μg/mL时，其对ABTS+·清除率为33.00%，结果显示，苦荞杆黄酮清除ABTS+·活性较优于常规自由基清除剂VC。

图8　苦荞秆黄酮和VC对ABTS+·清除活性Fig.8 Scavenging activity ofFagopyrum tataricumstraw flavonoids and vitamin C on ABTS+·

2.4.4还原能力的测定

本试验以苦荞秆总黄酮被铁氰化钾氧化来表征其还原力，其在波长700 nm处的吸光度值越大，表示其还原力越强［17］。由图9可知，随着样品质量浓度升高，总黄酮和VC于波长700 nm处的吸光度值逐渐增大，并且存在良好的线性关系，表明其还原能力逐渐增强；苦荞秆总黄酮的总体还原能力强于常规抗氧化剂VC。

图9　苦荞秆黄酮和VC还原能力的测定Fig.9 Reducing capacity ofFagopyrum tataricumstraw and vitamin C

3　结论

采用单因素试验，评价不同提取条件下总黄酮的提取率，设定超声波功率250 W，缓冲溶液pH值6.0。结合正交试验，探索了苦荞秆总黄酮的最佳提取工艺条件为纤维素酶10 mg/g，乙醇体积分数40%，超声温度为40℃，超声时间30 min，料液比为1∶40（g∶mL）。在最佳试验条件下平行3组总黄酮的得率为2.30%，各因素的影响次序为：乙醇体积分数＞超声时间＞纤维素酶＞料液比＞提取温度。

自由基清除活性评价结果显示，苦荞秆总黄酮具有较强的清除·OH、ABTS+·能力和还原能力，总黄酮对·OH、·、ABTS+·的半抑制浓度（IC50值）为0.181 mg/mL、0.235 mg/mL和2.240 μg/mL。对ABTS·+的清除效果最强，且苦荞杆对三者的清除作用都高于VC对其的清除作用。而且在试验范围内对三者的抗氧化活性呈现良好的量效关系，结果可为苦荞秆资源在饲料工业的合理开发及应用提供科学依据。

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Enzymatic-ultrasonic assisted extraction of total flavonoids fromFagopyrum tataricum straw and its antioxidant activity

YANG Haitao，CAO Xiaoyan*
（1.Shaanxi Key Laboratory of Catalysis，Shaanxi Sci-Tech University，Hanzhong 723000，China；2.School of Chemical&Environmental Sciences，Shaanxi Sci-Tech University，Hanzhong 723000，China）

TakingFagopyrum tataricumstraw from Qinba area as raw material，based on single factor experiments and orthogonal experiments，the extraction technology of total flavonoids fromF.tataricumstraw was studied by cellulase-ultrasonic method.The scavenging activity of total flavonoids on·OH，O2-·，ABTS+·and reducing power were investigated.The results showed that the optimum flavonoid extraction technology ofF. tataricumstraw was as follows：cellulase dosage 10 mg/g，ethanol concentration 40%，ultrasonic temperature 40℃，time 30 min and solid-liquid ratio 1∶40（g∶ml）.Under this condition，the extraction yield of total flavonoids was 2.30%.The IC50of total flavonoids towards·OH，O2-·，ABTS+·were 0.18 mg/ml，0.24 mg/ml and 2.24 μg/ml，respectively，which was superior to the natural antioxidants vitamin C.

Fagopyrum tataricumstraw；total flavonoids；cellulose；ultrasonic-assisted extraction；antioxidant activity

S567.9

0254-5071（2016）09-0072-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.017

2016-04-01

陕西省教育厅专项科研计划（2013JK0680）；陕西理工学院校级人才启动项目（SLGQD13-1）

杨海涛（1960-），男，教授，本科，研究方向为天然产物化学。

曹小燕（1982-），女，讲师，博士，研究方向为天然产物化学。