野薄荷组织培养脱病毒技术研究

谢文申 付晏昆 周露 张青华

摘要 [目的]采用热处理结合茎尖分生组织培养的方法，研究薄荷组培脱毒技术。[方法] 以薄荷組培苗为试材，在高温热处理不同天数后剥取茎尖，进行薄荷花叶病毒脱毒技术研究，同时采用RT-PCR法检测其脱毒效果。[结果]适合薄荷热处理时间为20～45 d，试管苗的成活率可达66.7%～90.0%；32～38 ℃热处理35～45 d剥取0.3～0.5 mm的茎尖进行培养，脱毒率为100.0%。[结论] 热处理结合茎尖培养是一种脱除薄荷病毒的有效途径。

关键词 薄荷；组织培养；热处理；脱毒；RT-PCR

中图分类号 S567.23+5 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）06-0061-02

Study on Virus-free Technique of Mentha haplocalyx by Tissue Culture

XIE Wen-shen 1 FU Yan-kun 2 ZHOU Lu 1 ZHANG Qing-hua 3

（1 Spice Research Institute of Yunnan Agricultural University，Kunming Yunnan 650051； 2 Kunming University； 3 College of Horticulture and Landscape of Yunnan Agricultural University）

Abstract [Objective] The technique of virus-free in Mentha haplocalyx was studied by combing tissue of shoot-tip with heating treatment.[Method] Mentha haplocalyx in vitro was used as test material in this experiment to eliminate by combing tissue of shoot-tip with heat therapy，and detected by indirect RT-PCR method.[Result] The suitable time for heat treatment was 20～45 days，the survival rate of tissue culture seedling was up to 66.7%～90.0%；0.3～0.5 mm shoot-tip with heat treatment by 32～38 ℃ for 35～45 days of Mentha haplocalyx were 100.0% free from CMV and TMV.[Conclusion] Combing tissue of shoot-tip with heating treatment is an efficient way of virus-free in Mentha haplocalyx.

Key words Mentha haplocalyx；tissue culture；heat treatment；virus-free；RT-PCR

薄荷（Mentha haplocalyx Briq），唇形科薄荷属多年草本。性凉味辛，以全草入药；具有清利头目、透疹功能，用于治疗风温初起[1-5]、风热感冒、头痛、麻疹、喉痹、风疹、目赤等症。薄荷是世界三大香料之一[4]，在国际市场上，薄荷主要作为食品、化妆品的添加剂，用来增加气味、改善口味等。现阶段，薄荷的市场需求量巨大。但薄荷在生长过程中，由于品种更新缓慢、易感毒、优良性状退化等原因，导致薄荷的产量和经济效益都大大降低[1，5-6]。薄荷的主要病毒是黄瓜花叶病毒（CMV）和烟草花叶病（TMV）[7]。

热处理主要是利用病毒和寄主植物对高温忍耐性的差异，当植物组织处于高于正常温度的适当高温环境时[1-5]，可部分或完全钝化植物组织中的病毒，但寄主植物组织很少或不会受到伤害。在马铃薯、草莓和葡萄的脱毒研究[8-13]中，热处理结合茎尖培养法的应用最多；而在观赏植物上，热处理在百合、大丽花和罗汉果的脱毒研究[14-19]中也有应用，脱毒效果均很好。尚未见该法应用于薄荷脱毒的研究报道。本文以感病野生薄荷为材料，采用“热处理+茎尖培养”的脱毒方法，培养脱毒薄荷组培苗的培养技术。

1 材料与方法

1.1 试验材料

田间选取表现花叶症状的野薄荷品种[1]，采用RT-PCR测定法，检测烟草花叶病毒（TMV）及黄瓜花叶病毒（CMV）。试验材料为经检验呈阳性的母株，采取其顶芽及带芽茎段为外植体[2]。

1.2 试验方法

1.2.1 准备脱毒材料。用饱和肥皂粉液刷洗外植体，要求清洗干净，在流水下冲洗60 min后，置于超净台。先用75%（体积分数）酒精加数滴吐温灭菌30 s，用无菌水涮洗3遍，每遍1 min，再添0.1%升汞灭菌8～10 min，最后用无菌水涮洗5～7遍[1-5]，每遍1 min。灭菌后将外植体转入启动培养基中进行培养。30 d后可转入继代培养基中进行继代培养，以继代的试管苗为外植体。

1.2.2 茎尖培养法。取1.2.1中试管苗的顶芽，借助解剖镜剥取茎尖，长度分别为0.3、0.5、0.8 mm，接种于继代培养基中，每个处理水平接种30个茎尖。在25 d后统计成活率，50 d后统计脱毒率。

1.2.3 热处理结合茎尖培养法。取1.2.1中试管苗的顶芽，借助解剖镜，剥取长度为0.8 mm的茎尖，接种于继代培养基中，15 d后进行热处理。主要采用昼夜变温及逐步升温的方式。热处理设置的最终温度为：白天38 ℃，晚上32 ℃。热处理前期采取逐步升温的方式对试管苗进行预处理，即设置白天起始温度为28 ℃，逐渐升至38 ℃时停止[1-6]；夜间起始温度为26 ℃，逐渐升至32 ℃时停止。这样经过预处理后再以白天38 ℃，晚上32 ℃，进行最终的热处理，分别继续处理30、40、58 d。在人工气候箱中完成热处理过程，人工气候箱光照时间、光照强度、相对湿度分别为14 h、2 000 lx、70%。热处理后对成活的试管苗剥取长度为0.4～0.5 mm的茎尖接种于启动培养基中，每个时间处理下接种30个茎尖。分别在10、15、20、25 d后统计成活率，50 d后统计脱毒率。计算公式如下：

成活率（%）=■×100

脱毒率（%）=■×100

1.2.4 培養基和培养条件。采用MS为基本培养基，附加不同浓度的BA、NAA。培养基煮沸后调pH值至5.8，注入培养瓶中，封口后于120 ℃高压锅中灭菌30 min。启动培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。继代培养基：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，生根培养基为1/2MS无激素培养基。以上培养基均添加0.7%琼脂、3%蔗糖。试验培养条件：培养室温度为（23±2）℃，连续光照时间12 h/d，光照强度1 500～2 000 lx。15～20 d继代1次。

1.2.5 病毒检测方法。待茎尖分化成苗后，取株高6～7 cm的薄荷试管苗，利用RT-PCR技术对CMV和TMV病毒进行检测，由云南农业大学植保学院进行病毒检测并出具检测报告。

2 结果与分析

2.1 茎尖培养中不同茎尖长度对薄荷成活率和脱毒率的影响

由表1可知，切取0.3～1.0 mm的薄荷茎尖分生组织均可诱导出绿苗，但茎尖大小对成活率影响较大，当茎尖<0.5 mm时，需培养15 d才出绿苗，约35 d才能形成正常植株，脱毒率可达80.0%，但成活率仅约50.0%[1-4]。当茎尖分生组织在1.0 mm时，10 d即可诱导出绿苗，约25 d形成小植株，成活率达90.0%，脱毒率只有63.0%。以后的继代周期只需要15～20 d。

2.2 不同热处理时间对薄荷茎尖成活率的影响

薄荷组培苗培养15 d后，放置于32～38 ℃光照培养箱中进行昼夜变温热处理。由表2可知，试管苗的成活率伴随着热处理时间的延长而逐渐降低。热处理15～25 d后，组培苗生长迟缓、叶片变黄，甚至枯亡。热处理30 d时，组培苗组织受损程度伴随热处理时间的延长而加剧，部分组培苗因不耐持续高温处理而死亡。当热处理至50 d时，成活率仅为23.3%。43 ℃处理的材料则全部死亡。因此，应选热处理35～45 d的试管苗。

2.3 热处理后茎尖培养对薄荷茎尖成活率的影响

选取热处理后成活的试管苗，剥取长度为0.3～1.5 mm不等的茎尖进行继代培养，60 d后统计成活率[1-4]。茎尖的大小与茎尖成活率、茎尖转绿时间密切相关。由表3可知，热处理10、20、35、45 d，剥离同样大小的茎尖，如1.0～1.5 mm，茎尖转绿时间17、30、39、50 d，成活率分别为100.0%、96.7%、80.0%、66.7%，表明热处理时间越长，茎尖组织受损越严重，茎尖转绿时间延长[2-5]，成活率降低。而同样热处理20 d，分别剥取0.3～0.5、1.0～1.5 mm的茎尖，茎尖转绿时间分别为36、30 d，茎尖成活率分别为90.0%、96.7%，说明热处理时间相同时，茎尖越小，茎尖转绿的时间越长，成活率也越低。

2.4 热处理后茎尖培养对薄荷茎尖苗脱毒效果的影响

待茎尖苗生长至株高6～7 cm时，检测茎尖苗的花叶病毒。结果表明，热处理时间及茎尖大小与茎尖苗的脱毒率的关系密切。由表3可知，热处理10、20、35、45 d后，剥取1.0～1.5 mm的茎尖，脱毒率分别为55.6%、72.8%、93.2%、96.7%，说明脱毒效果随着热处理时间的延长而越明显。热处理同样时间，如45 d时，剥取0.3～0.5、1.0～1.5 mm的茎尖，茎尖苗脱毒率分别为100.0%、96.7%，说明热处理时间一样时，茎尖大小和脱毒率呈负相关，茎尖越小，脱毒率越高。热处理10 d剥取1.0～1.5 mm的茎尖虽然成活率为100.0%，但脱毒率仅为55.6%；热处理45 d剥取0.3～0.5 mm的茎尖，虽然成活率仅为56.7%，但脱毒率为100%。因此，要保证既要有一定的成活率，又要获得较高的脱毒，以32～38 ℃热处理45 d剥取0.3～0.5 mm的茎尖效果最佳，成活率可56.7%，但脱毒率为100.0%。

2.5 脱毒苗的生根与移栽

经鉴定为脱除花叶病毒的薄荷茎尖苗，经继代2～3次后，选取长势良好的2～3 cm苗接种至生根培养基中进行生根培养[1-5]，当根长约2 cm时，从培养室中及时拿出已生根的试管苗，于室温、自然散射光下放置2～3 d后打开瓶塞炼苗2～3 d，将根系附着的培养基洗净，用多菌灵100倍液消毒后，将其栽入消过毒的蛭石和珍珠岩按1∶1比例混合而成的基质中，浇透水，覆盖塑料膜。在温度为20～25 ℃，相对湿度75%～80%的条件下进行练苗，注意遮荫和通风。10 d后去掉覆盖膜，2～3周后移栽苗成活，其成活率为95%。当薄荷苗长到5叶1心时，可及时移入大田中栽植。

3 结论与讨论

该文未采用单独的热处理方式，是因为CMV和TMV的耐热极限温度很高[1-3]，在此温度下薄荷无法存活，因此选用热处理结合茎尖培养法来实现脱毒。该文采用逐步升温后，昼夜变温和昼夜恒温2种方式。在温度逐步升高的过程中，试管苗逐渐得以锻炼，耐高温能力得以提高，成活率得以提高[1-2]。试验表明：昼夜变温有利于提高试管苗成活率。由于热处理温度一般要求达到38 ℃，采用33～38 ℃昼夜变温处理有利于缓解高温对苗木的伤害，提高茎尖培养的成活率、提高脱毒率，且热处理方法操作简便，但选择一个适宜的热处理方式是非常重要的。

该文研究显示，2种脱毒方法中，茎尖培养法中脱毒效果最好的是长度为0.3～0.5 mm的茎尖，茎尖成活率为50.0%，脱毒率为80.0%。热处理结合茎尖培养法中脱毒效果最好的是：经33～38 ℃昼夜变温处理45 d后剥取长度为0.3～0.5 mm的茎尖，茎尖成活率为56.7%，脱毒率为100%。

本研究首次将热处理结合茎尖培养脱毒技术用于野薄荷，摸索并总结了薄荷试管苗脱毒过程中的技术参数及操作要求。通过对再生苗的脱毒率检测，证明了热处理结合茎尖培养应用于薄荷脱毒的可行性，将成为薄荷无病毒苗生产上的有效方法。

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