人Arresten基因真核表达质粒的构建

曹凯，孟庆义，王瑞华，刘兆轩，王荣飞

(1潍坊医学院，山东潍坊261053；2山东大学附属济南市中心医院)



人Arresten基因真核表达质粒的构建

曹凯1，孟庆义2，王瑞华2，刘兆轩2，王荣飞2

(1潍坊医学院，山东潍坊261053；2山东大学附属济南市中心医院)

目的构建人Arresten基因的真核表达质粒。方法 设计人Arresten基因引物序列，取100 mg新鲜的胎盘组织提取总RNA，采用RT-PCR 法扩增Arresten基因。将获取的Arresten基因片段和pIRES2-EGFP质粒分别用BamH Ⅰ和EcoRⅠ作双酶切，将酶切产物与质粒连接，转化感受态大肠杆菌DH-5α进行真核表达。采用酶切、菌液PCR及测序的方法检测Arresten基因真核表达质粒构建的正确性。结果 经双酶切鉴定，得到1条约700 bp的片段和1条与pIRES2-EGFP空载体(5.3 kb)相近的片段，符合Arresten基因重组质粒大小。经重组质粒的菌液PCR鉴定，7组菌液均扩增出700 bp 大小的扩增片段，均为阳性克隆。测序结果示，Arresten基因mRNA与GenBank中人Arresten序列完全一致。结论 成功构建了人Arresten基因的真核表达质粒。

Arresten基因；表皮生长因子受体质粒；真核；酶切；血管狭窄

血管移植术、血管腔内成形术等血管重建术是目前治疗冠状动脉及外周动脉狭窄或闭塞性疾病的重要方法，但血管重建术后血管狭窄或再狭窄的发生率高达30%～50%，严重影响了远期疗效[1,2]。一旦血管重建术后血管内再狭窄形成，就需要再次行血管移植术或血管内支架置入术等手术治疗。虽然国内外学者对血管重建术后再狭窄的防治进行了大量研究，但目前临床现有的药物均未能有效降低血管重建术后血管再狭窄的发生率[3]。因此，寻找有效的方法防治血管重建术后血管再狭窄已成为血管外科和心脏外科急需解决的研究课题之一。Arresten基因是Colorado等[4]发现的一种强效的血管生成抑制因子，属于Ⅳ型胶原αⅠ链羧基端NCI结构多肽片段，其DNA编码序列长度为690 bp，相对分子量约为26 kD，在防治血管再狭窄方面具有广阔的应用前景。2014年9月～2015年7月，我们从健康产妇胎盘组织中提取总RNA，用 RT-PCR方法扩增出Arresten cDNA，构建pIRES2-EGFP-Arresten重组质粒，探讨Arresten基因真核表达质粒的构建方法，为对其的进一步研究提供实验基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂胎盘组织由济南市中心医院妇产科提供，TRIzol试剂为Invitrogen产品。质粒pIRES2-EGFP为Hanbio公司产品；大肠杆菌菌株DH-5α为Tiangen公司产品；限制性核酸内切酶、T4连接酶和DNA Ladder Marker为Fermentas公司产品；质粒小、大量抽提试剂盒为康为世纪公司产品；胶回收试剂盒为上海生工生物工程有限公司产品。

1.2Arresten基因引物设计与合成 根据唐海英等报道的Arresten基因克隆引物序列[5]设计引物，引物内含有BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶切位点。Arresten上游引物5′-GCCGAATTCATGTCTGTTGATCACGGC-3′，下游引物5′-GCGGATCCCTATTATTATGTTCTTCTC-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3胎盘组织总RNA提取取100 mg新鲜的胎盘组织于液氮中，迅速研磨成粉末，加入TRIzol 1 mL混匀，室温放置5 min，使其充分溶解。离心5 min后弃沉淀，加入氯仿0.2 mL，振荡混匀后离心15 min。吸取上层水相，在其中加入异丙醇0.5 mL，混匀后放置10 min，离心弃上清，加入75%乙醇1 mL，离心后弃上清。室温晾干后用20 μL RNase-free水溶解。

1.4Arresten基因扩增采用RT-PCR 法。按反转录试剂盒说明合成cDNA第一链，然后以cDNA第一链为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：5×PCR Buffer 10 μL，cDNA 2 μL，灭菌蒸馏水26.75 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，Taq酶0.25 μL，总体积40 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min循环35次，72 ℃延伸5 min。产物行琼脂糖凝胶电泳，胶回收Arresten基因片段。

1.5pIRES2-EGFP-Arresten重组质粒的构建 将获取的Arresten基因片段和pIRES2-EGFP质粒分别用BamH Ⅰ和EcoRⅠ作双酶切，酶切产物作琼脂糖凝胶电泳及胶回收，回收产物与质粒在T4DNA连接酶作用下16 ℃连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH-5α。将含有重组质粒的菌液平铺于含有Ampicillin的LB琼脂平板37 ℃培养过夜，挑选白色阳性克隆菌落，提取重组质粒。

1.6鉴定方法 所得的重组质粒作BamH Ⅰ和EcoRⅠ双酶切后用琼脂糖凝胶电泳鉴定，随机挑取7个阳性菌落，琼脂糖凝胶电泳后染色分析，凝胶成像仪观察并记录结果。选取含有重组质粒的阳性菌落，送至上海桑尼生物技术有限公司测序。将所得序列与GenBank中人Arresten序列进行比对。

2　结果

2.1人Arresten cDNA鉴定结果在约700 bp处扩增出一条特异性目的基因片段，与预计电泳结果大小相符。

2.2pIRES2-EGFP-Arresten重组表达质粒鉴定结果BamH Ⅰ和EcoRⅠ双酶切后，得到1条约700 bp的片段和1条与pIRES2-EGFP空载体(5 300 bp)相近的片段，重组质粒构建成功。见图1。

注：1为重组质粒pIRES2-EGFP-Arresten；2为重组质粒pIRES2-EGFP-Arresten双酶切鉴定结果；M为DNA Marker。

图1pIRES2-EGFP-Arresten酶切鉴定结果

2.3重组质粒的菌液PCR鉴定结果7组菌液均扩增出700 bp 大小的扩增片段，均为阳性克隆。见图2。

注：1～7为各阳性菌落；M为DNA Marker。

图2重组质粒的菌液PCR鉴定结果

2.4Arresten基因测序结果测序结果示，Arresten基因mRNA的长度为690 bp，与GenBank中人Arresten序列完全一致，表明目的基因正确插入质粒pIRES2-EGFP中，pIRES2-EGFP-Arresten重组质粒构建成功。

3　讨论

研究表明，血管重建术后血管狭窄或再狭窄的主要特征是血管内膜增生。血管重建术后，炎症反应、组织损伤等多种因素共同激活细胞内调节细胞增殖和迁移的基因，最终导致血管平滑肌细胞增殖以及从血管中膜迁移到内膜，导致血管内膜增生，使血管腔狭窄或闭塞[6,7]。因此，血管平滑肌细胞的过度增殖并迁移至内膜，是血管重建术后移植静脉段发生再狭窄过程中的重要环节[8]。

基因治疗是指将目的基因通过治疗载体导入到病变部位，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病，已应用于临床治疗中[9]。Arresten基因是新近发现的一种内源性血管生成抑制因子，在同等剂量下，Arresten抑制内皮细胞增殖和血管生成的作用是血管内皮抑素的3倍和10倍[4]。已有研究表明，Arresten可以有效抑制血管内皮细胞的迁移、增殖和血管管腔的形成[10]，可以作为防治血管移植术后再狭窄的靶基因。宋自芳等[11]研究发现，Arresten重组蛋白可有效抑制血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖和迁移。因此，应用Arresten基因治疗血管重建术后再狭窄及闭塞性疾病具有广阔的临床应用前景。

pIRES2-EGFP作为非病毒载体，具有易制备、低毒、无免疫原性、无致癌性等优点[12]，能使目的基因蛋白充分表达，有效检测其转染效率，利于发挥基因的生物学活性，减少细胞毒性等优势，而且克服了单纯应用裸基因转染效率低、易被溶酶体降解等弊端，符合基因治疗的要求[13～15]。Arresten因子在胎盘组织中表达高，因此我们从健康产妇胎盘组织中提取总RNA，设计Arresten引物并在其两端加入酶切位点，通过RT-PCR技术特异性扩增出目的基因，采用基因重组技术，将Arresten基因克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中，构建pIRES2-EGFP-Arresten重组质粒。本研究中，通过对重组质粒行酶切、菌液PCR鉴定，显示pIRES2-EGFP-Arresten重组质粒构建成功，DNA测序证实重组质粒构建正确，提示成功构建了重组质粒pIRES2-EGFP-Arresten。本研究构建的pIRES2-EGFP-Arresten重组质粒为深入开展Arresten基因功能的研究和基因治疗提供了实验基础。

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Construction of eukaryotic expression plasmid of human Arresten gene

CAOKai1,MENGQingyi,WANGRuihua,LIUZhaoxuan,WANGRongfei

(1WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China)

ObjectiveTo construct the eukaryotic expression plasmid of Arresten gene. MethodsWe designed the human Arresten gene clone primer sequence. The total RNA was extracted from 100 mg fresh placenta tissues, and the Arresten gene was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The Arresten gene fragment and pIRES2-EGFP plasmid were digested with BamH I and EcoR I, respectively. The enzyme digestion product was connected with the plasmid, and transformed into E.coli DH-5α. The Arresten eukaryotic expression plasmid was identified with double enzyme digestion and colony-PCR and DNA sequencing. Results An about 700 bp fragment and a fragment similar to the pIRES2-EGFP empty plasmid (5.3 kb) were obtained by double enzyme digestion, which were consistent with the size of Arresten gene recombinant plasmid. Seven groups of bacteria all amplified about 700 bp amplified fragments, which were all positive clones after colony-PCR. The sequencing results showed that the mRNA gene and GenBank sequence were completely consistent. ConclusionThe eukaryotic expression plasmid of human Arresten gene was successfully constructed.

Arresten gene; epidermal growth factor receptor plasmid; eukaryotic; enzyme digestion; angiostenosis

曹凯(1989-)，男，硕士研究生，主要研究方向为基因治疗血管移植后再狭窄的防治。E-mail: 1058968424@qq.com

简介：孟庆义(1962-)，男，教授，主要研究方向为血管移植后再狭窄的防治。E-mail: 13370582128@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.30.007

R318.0

A

1002-266X(2016)30-0025-03

2016-01-09)