降解菌DNEH-S1的室内模拟试验

张 奇

（东北农业大学，哈尔滨 150036）

降解菌DNEH-S1的室内模拟试验

张 奇

（东北农业大学，哈尔滨 150036）

农业生产中广泛使用的农药、地膜、化肥等农用化学品，造成多种有机物对土壤的复合污染。当有害物质过多，超过土壤的自净能力，就会引起土壤的组成、结构和功能发生变化，微生物活动受到抑制，有害物质或其分解产物在土壤中逐渐积累，并间接危害人体健康。邻苯二甲酸酯（PAEs）是一类环境内分泌物质，作为农用塑料地膜中的增塑剂被大量使用，易从塑料地膜中释放而造成土壤污染。我国农田土壤普遍存在农药、PAEs等有机物复合污染，生物降解是削减土壤中有机污染物的重要途径。试验研究了降解菌DNEH-S1在土壤中对DEHP降解特性及土壤中养分的动态变化，探讨了典型有机物复合污染土壤生物降解技术的可行性。

邻苯二甲酸酯；生物降解；土壤修复；模拟试验

1　前言

DEHP是人工合成的化学物质，其的中文名为邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯，广泛应用于塑料制品中，包括农用薄膜和塑料大棚膜。我国每年地膜使用量近百万吨，地膜覆盖面积达1000多万公顷，覆盖作物达40多种［1］。聚乙烯类地膜以其质轻、透光、保温保湿性好，在我国被广泛应用于冬季暖棚蔬菜生产及早稻、西瓜、棉花等地覆膜育秧，但随着地膜老化、破碎和回收不净，造成地膜在田间的残留量不断增加［2］。大量残留地膜不但对农田耕作、植物生长等造成影响，其深层次的影响还在于地膜中的增塑剂（邻苯二甲酸酯类化合物（PAEs），又称酞酸酯）的污染。

当大量PAES进入土壤环境中，土壤微生物群落的数量、结构和多样性都会受到影响，最终使土壤生态系统的功能受到损害［2-5］。PAEs在植物体中有较强的富集作用，甚至在它们的深加工产品中都发现了PAEs的存在［6］。DEHP浓度增加，叶绿素含量逐渐下降，DEHP10mg/kg时，豇豆叶绿素a含量比空白下降8.6%，叶绿素b含量比空白下降13.3%；DEHP50mg/kg时，豇豆叶绿素a含量下降23.5%，叶绿素b含量下降26.7%［7］。

人类通过皮肤、呼吸、食物链等途径长期接触环境雌激素PAEs，可能导致人肢体畸形、内分泌失调、生殖系统病变，精子数量减少，乳腺癌发病率升高等不良后果，而且可以通过胎盘和授乳产生跨代影响［8］。总之，邻苯二甲酸酯类对人类和其他生物都存在潜在危害。

DEHP是我国优先控制的PAEs类污染物之一，在环境中难以自发降解，在土壤中的残留量大，威胁生态安全。因而找到可行性高、效果好的方法控制和降低DEHP在环境中的含量和危害刻不容缓。由于常规处理方法难以对其有较好的处理，因此，利用微生物降解DEHP修复污染土壤是当前的研究热点。

本研究在室内条件下将DEHP降解菌DNEH-S1施用于DEHP污染土壤中，探究了该降解菌在土壤中的实际修复效果及修复过程中土壤养分含量的变化。以期为DEHP污染土壤的生物修复提供依据。

2　材料与方法

2.1仪器与试剂

仪器：UV-2051PC紫外可见分光光度计；TPY-6土壤养分快速测试仪。

试剂：DEHP标准溶液（纯度≥99%）；三氯甲烷（分析纯）；乙醇（分析纯）；N、P、K养分测试试剂。

2.2测定方法

2.2.1土壤中DEHP含量的测定

2.2.1.1土壤中DEHP的萃取

土壤经风干、研磨、过筛，用10 mL三氯甲烷超声萃取二次，每次萃取时间10min。

2.2.1.2土壤中DEHP含量测定

（1）测定波长选择：以三氯甲烷为空白，作扫描基线校正。并对DEHP和样品检测液在一定波长范围内进行扫描，标准品及样品均在某一波长处有最大吸收峰，即可确定为最佳吸收波长。

（2）标准曲线的绘制：准确移取DEHP 标准溶液，用三氯甲烷溶解并定容，分别配制成一定浓度的系列标准溶液。在最佳波长下，利用紫外分光光度计测定上述系列标准溶液，以吸光度对DEHP 质量浓度进行线性回归，得出线性回归方程及相关系数。

（3）回收率试验：向无DEHP土壤中加入一定量的已知浓度的DEHP标准溶液，用三氯甲烷进行萃取。对萃取后溶液进行DEHP含量的测定，计算样品回收率。

（4）样品测定：分别取3份土样，用三氯甲烷萃取，在最佳波长下用紫外分光光度计对萃取后溶液进行测定，得出其吸光度，利用标准曲线，计算DEHP的含量。

2.2.2土壤中速效养分含量的测定

土壤中N、P、K含量：依照TPY-6土壤养分快速测试仪说明书进行。

2.3试验设置

供试土壤采自东北农业大学校内，分为处理组和对照组。在供试土壤中加入一定量的DEHP，使两组土壤中DEHP含量达到50mg/kg，在处理土壤中接入一定量的DEHP降解菌DNEH-S1，对照组土壤中不接入菌。将两组样品置于25℃的培养箱中，为防止DEHP光解造成误差，在三角烧瓶外裹锡纸，并且在修复试验期间定期补无菌水。本试验中的降解菌DNEH-S1来自于东北农业大学资环学院环境污染生物修复研究室，经16S的DNA鉴定为Pseudomonas aeruginosa。

3　试验结果与分析

3.1土壤中DEHP的含量

3.1.1最佳吸收波长确定

以三氯甲烷为空白对DEHP和样品检测液在250～ 700nm波长范围内进行扫描，样品在275nm波长处有最大吸收峰，故选择275nm为测定波长。

3.1.2DEHP标准曲线的绘制

准确移取DEHP标准溶液，用三氯甲烷溶解并定容，分别配制成30、50、70、90、100mg/L的标准系列溶液，用紫外分光光度计测定上述系列标准溶液在275nm波长处的吸光度。以吸光度对DEHP质量浓度进行线性回归，得DEHP标准曲线图及线性回归方程，如图1所示。相关系数R2 = 0.9911，表明该方法线性关系良好，测定数值比较准确。

图1　DEHP的标准曲线

3.1.3回收率试验

向100g土壤中，分别加入70mg/kg和100mg/kg的DEHP标准品，充分混匀后取10g样品，用10mL三氯甲烷进行萃取，用“1.5”方法对萃取后溶液进行5次平行测定，试验结果如下表所示。

由表可知，DEHP 的回收率为92.02%～102.93%，表明样品的回收率可靠。

3.1.4降解菌修复效果研究

本试验研究了6周内DNEH-S1菌株对污染土壤的修复效果，如图2所示。对照组土壤中在整个修复过程中DEHP含量降低了3.09mg/kg，降解率为6%，这可能是因为土壤中原生微生物群落对DEHP有一定的降解效果。

处理组初始DEHP浓度为50mg/kg，6周之后处理组土壤中DEHP含量下降为10.56mg/kg，降解率高达79%，说明降解菌DNEH-S1在土壤中修复效果较好，可以进行进一步的应用研究。

DEHP加标回收试验结果表

图2　降解菌修复效果

本试验研究了6周内处理组与对照组土壤内速效氮含量的变化，如图3所示。对照组土壤中在整个修复过程中速效氮的含量变化较小，变化可能是因为土壤中原生微生物群落对土壤中的氮有一定的吸收效果。

处理组初始速效氮浓度为10.44mg/L，6周之后处理组土壤中速效氮含量下降为9.01mg/L，吸收率高达13.70%。

本试验研究了6周内处理组与对照组土壤内速效磷含量的变化，如图4所示。对照组土壤中在整个修复过程中速效磷的含量变化较小，变化可能是因为土壤中原生微生物群落对土壤中的磷有一定的吸收效果。

处理组初始速效磷浓度为9.51mg/L，6周之后处理组土壤中速效氮含量下降为7.80mg/L，吸收率高达17.98%。

本试验研究了6周内处理组与对照组土壤内速效钾含量的变化，如图5所示。对照组土壤中在整个修复过程中速效钾的含量变化较小，变化可能是因为土壤中原生微生物群落对土壤中的钾有一定的吸收效果。

处理组初始速效钾浓度为54.69mg/L，6周之后处理组土壤中速效钾含量下降为39.63mg/L，吸收率高达27.54%。

图3 修复期间土壤中N含量

图4　修复期间土壤中P含量

3.2修复过程中土壤N、P、K含量变化

图5　修复期间土壤中K含量

综上所述，修复过程土壤中的N、P、K含量变化如图3、图4、图5所示。在整个修复过程中，处理组土壤N、P、K含量均大幅降低，对照组土壤中N、P、K含量在整个试验过程中基本保持不变，可见该降解菌在土壤中生长状况良好，能适应该土壤的生活环境，具有持续开发的潜力，可进行进一步的研究与应用。

4　结论

邻苯二甲酸酯（PAEs）作为农用塑料地膜中的增塑剂被大量使用，易从塑料地膜中释放出而造成土壤污染。我国农田土壤普遍存在农药、PAEs等有机物复合污染，经试验验证，生物降解是削减土壤中有机污染物的重要途径。本试验研究了降解菌DNEH-S1在土壤中对DEHP降解特性及土壤中速效养分的动态变化，探讨了典型有机物复合污染土壤的生物降解的技术可行性。

综合本试验结果，得出以下结论：

初始DEHP浓度为50mg/kg，6周之后处理组土壤中DEHP含量下降为10.56mg/kg，降解率高达79%，由试验结果可知，降解菌DNEH-S1对于土壤中DEHP污染有较好的修复效果。

在连续6周的营养物监测试验中，速效N、P、K含量不断降低，说明降解菌DNEH-S1在土壤中生长状况良好，能适应该处土壤环境。具有持续开发的潜力，可以进行进一步的研究与应用。

［1］ 何文清，严昌荣，赵彩霞，等.我国地膜应用污染现状及其防治途径研究［J］.农业环境科学学报，2009，28（3）：533-538.

［2］ 滕应，黄昌勇.重金属污染土壤的微生物生态效应及其修复研究进展［J］.土壤与环境，2002，11（1）：85-89.

［3］ 谢慧君，石义静，滕少香，等.邻苯二甲酸酯对土壤微生物群落多样性的影响［J］.环境科学，2009，30（5）：1286-1291.

［4］ Liang，D W，Fang H H P，Zhang T. Microbial characterization and quantification of an anaerobic sludge degrading dimethyl phthalate.［J］.Journal of Applied Microbiology，2009，106（1）：296-305.

［5］ 苗静，祝惠，王鑫宏，等. DOP与Pb单一及复合污染对土壤酶活性的影响［J］.环境科学研究，2009，22（7）：856-861.

［6］ 安琼，靳伟.酞酸酯类增塑剂对土壤-作物系统的影响［J］.土壤学报，1999，36 （1）：118-126.

［7］ 王曙光，林先贵，尹睿.土壤中酞酸酯（PAEs）对丛枝菌根化植物生长的影响［J］.生态与农村环境学报， 2003，19（1）：31-35.

［8］ 王丽霞.保护地邻苯二甲酸酯污染的研究［D］.山东农业大学，2007.

Indoor Simulation Examination of Degradation Bacteria DNEH - S1

ZHANG Qi
（Northeast Agricultural University， Harbin 150036， China）

Phthalic acid esters （PAEs） is a kind of environmental endocrine substances that is widely used as the plasticizer in the farming-use plastic film， easy to release from the plastic film and cause soil pollution. Farmland soils commonly show pesticides， PAEs and other organic compound pollution in China and biodegradation is an important approach to cut down organic pollutants in soil. This experiment studies the degradation bacteria DNEH - S1 in the soil of DEHP degradation charac-teristics and the dynamic changes of the nutrients in the soil， discussing the bio-degradation technology feasibility of typical organic compound contaminated soil.

DEHP； bio-degradation； soil remediation； simulated test

X53

A

1006-5377（2016）09-0052-04