酶解技术在腰果蛋白制备中的应用

高林，朱小天，邓晶晶，梁宇，吴继红

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，国家果蔬加工工程技术研究中心，农业部果蔬加工重点开放实验室，北京100083）

酶解技术在腰果蛋白制备中的应用

高林，朱小天，邓晶晶，梁宇，吴继红*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，国家果蔬加工工程技术研究中心，农业部果蔬加工重点开放实验室，北京100083）

以剥壳后所得等外果及碎腰果果仁为原料，采用低温冷榨取油结合溶剂浸提的方法，获得二浸腰果饼粕，将其油脂含量降低至2.99%，蛋白含量为34.61%；利用酸沉淀法，结合α-淀粉酶的作用对腰果蛋白进行提取，探究酶添加量、酶解温度、酶解pH、酸沉淀pH、料液比对所得蛋白纯度的影响，确定最佳提取条件为：α-淀粉酶添加量为底物量的2.0%、酸沉pH为4.50；选取酶解pH、料液比、温度3个因素作为响应面优化因素进一步优化了工艺参数并结合实际，最终获得最佳提取工艺为：pH7.0、温度60℃、料液比1∶10（g/mL），产品粗蛋白纯度可达到64%。

腰果；植物蛋白；酶解技术；α-淀粉酶；工艺优化

腰果（Anacardium occidentale L.）又名介寿果、鸡腰果，为世界著名四大干果之一［1］。腰果仁美味可口，营养价值丰富，深受消费者喜爱［2］。目前市面上比较常见的产品除未经加工的生腰果，多以奶香腰果、炭烧腰果、盐焗腰果等初加工产品为主［3］。随着人们生活水平的提高与保障腰果产业的良性发展，对等外果及碎果仁的进一步利用，进行精深加工成为腰果产业势在必行的发展趋势。

腰果仁蛋白质含量（约20%）丰富，且蛋白质的氨基酸组成种类齐全，人体必需氨基酸占氨基酸总含量的31%，约占腰果仁蛋白质总量的25%，符合营养学规定的必需氨基酸需求量与蛋白质需求量的比例范围（20%～37%）［4］。且其氨基酸组成比例与WHO建议的人体氨基酸模式非常接近，优于其它坚果类产品如杏仁、榛子、核桃等［5］。鉴于目前腰果市场产品形式单一、产业附加值低、腰果蛋白市场空缺，对其制备工艺的探索可以为延长腰果深加工产业链并实现腰果碎果仁资源综合利用提供理论指导，具有重要意义。

由于腰果脱油后的饼粕中含有与蛋白含量相当的淀粉，对腰果蛋白质提取和纯化具有一定的影响，将酶解技术应用于腰果蛋白的提取工艺，即选取α-淀粉酶将淀粉水解为可溶解于体系液相中的糊精、低聚糖、麦芽糖及葡萄糖，使其得到有效去除，同时达到提高蛋白得率、改善蛋白品质的目的。本研究对原料进行低温冷榨结合溶剂浸提脱除油脂后，通过α-淀粉酶作用于蛋白提取工艺，探究酶解技术应用于腰果蛋白制备工艺的最优参数。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

带壳腰果：山东万思顿农业产业园有限公司非洲科特迪瓦种植基地；腰果仁：由该公司经其意大利进口自动化生产线剥壳后所得产品中的等外果及碎腰果果仁。

α-淀粉酶（酶活力20 000 U/g）：诺维信生物技术有限公司；石油醚、氢氧化钠、硼酸、五水合硫酸铜硫酸铵、浓硫酸、浓盐酸、无水乙醇、甲基红等（均为分析纯）：购买于北京化工厂。

1.2主要仪器与设备

泰航牌液压式榨油机180：郑州泰航机械设备有限公司；PB-10Sartorius pH计：赛多利斯科学仪器有限公司；LKTC-CZ水浴恒温振荡器：金坛市荣华仪器制造有限公司；BSXT-02索氏提取器：上海比朗仪器有限公司；KDY-9820凯氏定氮仪：KETUO公司；DHG-9053A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；HJ-4A数显恒温多头磁力搅拌器：金坛市杰瑞尔电器有限公司；BSA822电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司等。

1.3试验方法

1.3.1腰果压榨饼粕的制备

原料经过清理、除杂等工序后，用一层纱布包裹，采用液压式榨油机进行冷榨处理，升压速率为4 MPa/ min，升压至40 MPa，保持3 min后泄压排渣，重复2次后，得到压榨腰果饼粕［6］。

1.3.2腰果脱脂粉的制备

取腰果压榨出油后饼粕，按照如下步骤制备腰果脱脂粉［7］：压榨后饼粕→烘干（置于50℃烘箱中烘干24 h）→万能粉碎机粉碎→过筛→低温浸提除油以1∶5（g/mL）的料液比，向物料中加入石油醚，于常温下置于磁力搅拌器上搅拌浸提12 h，料液分离，重复3次，最后常温脱除溶剂→粉碎并过筛→获得腰果脱脂粉。

1.3.3腰果蛋白粉提取工艺

腰果脱脂粉→以一定料液比加入蒸馏水搅拌调浆→调节溶液pH（溶解）→加入α-淀粉酶→恒温水浴震荡→沸水浴灭酶→冷却至常温→盐酸调pH（酸沉淀）→离心→取沉淀→冷冻干燥→腰果粗蛋白粉产品［8］。

1.3.4指标测定

水分含量测定：GB 5009.3-2010《食品安全国家标准食品中水分的测定》；蛋白质含量测定：GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；脂肪含量测定：GB/T 14772-2008《食品中粗脂肪的测定》。

1.3.5响应面设计优化提取工艺

采用Box-Behnken中心组合试验设计原理［9］，结合单因素试验结果，探究酶解pH值、料液比、酶解温度对蛋白产品纯度的影响，因素及水平见表1。

表1　提取响应面优化因素水平表Table 1Factors and levels in the RSM of protein extraction

2　结果与分析

2.1不同加工阶段腰果蛋白质和脂肪的变化

由于新鲜腰果含油量约50%，若企业采用液压式压榨机进行二次冷压榨，尽管可获得大部分油脂，但饼粕残油率仍高达28%。加之腰果不同于其他含油原料，其淀粉含量较高，冷榨或热榨过程中，淀粉对出油率的提高带来一定限制。为了降低多次压榨的成本，本试验采用溶剂提取的方法进一步将脂肪脱除，不同加工阶段腰果的蛋白质和脂肪含量见表2。

表2　不同加工阶段腰果的蛋白质和脂肪含量Table 2Protein and oil content of cashew nut in various stages

由表2可知，通过不同的脱脂工艺，最终获得油脂含量2.99%的脱脂腰果粉，其蛋白含量约为35%。

2.2酶解单因素对蛋白提取的影响

2.2.1α-淀粉酶添加量对蛋白提取的影响

α-淀粉酶添加量对蛋白提取率的影响如图1所示，α-淀粉酶添加量为0%～2.0%时，蛋白产品的纯度随α-淀粉酶添加量的增加而显著提高，当酶量为2.0%时，纯度可达54%，可能是加入淀粉酶可有效促进淀粉发生水解［10］，同时影响到细胞壁的碳骨架，有助于细胞内蛋白质、油脂释出；加入4.0%、6.0%、10.0%、12.0%的α-淀粉酶酶解，产品差异不显著，且均显著低于2.0%的提取率，说明在2.0%的α-淀粉酶可以充分与底物作用使淀粉水解［11］，最终确定α-淀粉酶添加量为底物量的2.0%。

图1　α-淀粉酶添加量对粗蛋白纯度的影响Fig.1Effect of enzyme dosage on purity of cashew protein

2.2.2溶液pH值对蛋白提取的影响

以试验用酶的参考pH值范围5.5～7.5进行单因素试验，随着酶解pH值的增加，粗蛋白纯度先增加，在酶解pH值7.0处达到最大，之后又下降。蛋白质在低于和高于其等电点pH值，带有净的正电荷或净的负电荷，带电的氨基酸残基的静电推斥和水合作用促进蛋白质的溶解［12-13］。由于腰果蛋白质大多为酸性蛋白质［14］，其在酸性溶液（pH值为5.5～6.5）时溶解度较低，加上过低的pH值会抑制酶的活性，而同时溶液过高的pH值会使得酶失活从而降低蛋白的溶解率和淀粉的水解率［15］，且pH值越高蛋白越容易发生乳化现象，只有在特定的pH值条件下（6.5～7.5）如图2，才能处于最佳解离状态。

图2　酶解pH值对粗蛋白纯度的影响Fig.2Effect of solution pH on purity of cashew protein

2.2.3提取温度对蛋白提取的影响

图3所示，随着酶解温度的增加，蛋白质含量先增加，在酶解温度55℃左右达到最大，之后又迅速下降。一方面，温度的升高可以提高反应速率，另一方面，温度促使腰果蛋白亲水基团展开，有助于其溶解度升高［16］；酶解温度过高粗蛋白纯度下降可能是由于淀粉酶被钝化［17］，或腰果蛋白的疏水基团被过多的展开而使得蛋白质分子之间相互聚集，溶解度下降所致［18］。

图3　酶解温度对粗蛋白纯度的影响Fig.3Effect of temperature on purity of cashew protein

2.2.4酸沉淀pH值对蛋白提取的影响

蛋白质的溶解性受到料液pH的影响，当料液pH值接近蛋白质等电点时，主要蛋白质将不溶于液相中［19］（但仍有少量的低分子蛋白会溶解，所以会有部分蛋白质的损失），而可溶性糖类、淀粉酶作用后的淀粉水解物、其他可溶性物质，都可以溶解于水中［20］，因此可利用酸溶液调节料液pH值，将脱脂腰果粉中的可溶性非蛋白质成分去除，从而获得腰果蛋白。由图4可见，随着酸沉pH值增大，所获得的蛋白纯度先增大，在pH值4.5～5.0处达到最大，之后又逐渐下降，说明腰果蛋白的等电点应在pH值4.5～5.0之间，最后选取酸沉淀pH值为4.5。

图4　酸沉淀pH值对粗蛋白纯度的影响Fig.4Effect of pH of acid extraction solution on purity of cashew protein

2.2.5料液比对蛋白提取的影响

料液比对腰果蛋白提取的影响如图5所示，随着提取液体积的增加，所得蛋白的含量逐渐增大，但料液比为1∶10（g/mL）和1∶12（g/mL）时，没有显著性差异（P＞0.05），说明当料液比达到1∶10（g/mL）时，物料在提取液中已较为完全分散开，蛋白质溶解达到饱和，酶解反应充分［21］。由于加水量过多，酸沉时上清液中残留的清蛋白量增加，不容易被离心下来，造成较高的蛋白的损失［22］，试验操作中就可以看出，加水量更多的料液比组合将不再被继续探究。

图5　料液比对粗蛋白纯度的影响Fig.5Effect of solid-to-liquid ratio on purity of cashew protein

2.3响应面优化酶解提取蛋白工艺

应用Design Expert 8.0软件进行分析，得到二次多项回归模型为：粗蛋白产品纯度/%=+62.69+3.47×A+ 3.52×B+5.08×C-2.00×A×B-1.02×A×C+0.65×B×C-2.51× A2-7.69×B2-4.55×C2。ANOVA分析结果表明，模型P值小于0.01，而失拟的P值大于0.05，方程的相关系数R2=0.996 8，CV值为2.43%共同说明了模型的可靠性，能够较好地反映真实的试验值［23］。

表3　响应面分析法的ANOVA分析Table 3ANOVA of the constructed regression model

表3中显示，3个因素的线性、平方项影响均为极显著，酶解pH和料液比的交互影响显著，说明这些因素对蛋白提取均有显著性影响。各因素之间的交互作用进行响应面分析，绘制响应面曲线图，从等高线图可以直观反映出两个变量间相互的作用。两因素之间交互作用的等高线和响应面图见图6。

如图6所示，酶解pH值和料液比的等高线呈椭圆形表明，交互作用对腰果蛋白提取影响显著，其它因素两两交互的等高线图呈圆形，表明其作用不显著。通过软件分析计算得出理论最佳提取工艺条件为：pH值7.16、温度57.77℃、料液比1∶10.13（g/mL）。此时理论提取率为65.21%。为便于实际控制，选择提取pH 7.0、温度60℃、料液比1∶10（g/mL）进行验证试验，得到的粗蛋白纯度为64.10%，与理论值差别不大（1.70%）。

图6　两因素之间交互作用的等高线和响应面图Fig.6Contour line and curve surface for the effect of two-factor on extraction efficiency

3　结论与展望

采用压榨与溶剂浸提结合的方法对剥壳后所得的等外果及碎腰果果仁脱除油脂，获得腰果脱脂粉，其油脂含量降低至2.99%，蛋白含量达到34.61%；利用酸沉淀法，结合α-淀粉酶的作用对腰果蛋白进行提取，探究酶添加量、酶解温度、酶解pH值、酸沉淀pH值、料液比对粗蛋白纯度的影响，确定最佳提取条件为：α-淀粉酶添加量为底物量的2.0%、酸沉pH值为4.5；选取酶解pH值、料液比、温度3个因素作为响应面优化因素进一步优化了工艺参数，pH值7.0、温度60℃、料液比1∶10（g/mL），产品粗蛋白纯度可达到64%。

本实验通过腰果蛋白的提取研究，旨在为延长腰果深加工产业链并实现资源综合利用，开发营养价值高、产品质量稳定性好、工艺简单且有利于工业化生产的高附加值腰果蛋白产品提供理论指导，今后还将继续对腰果蛋白粉冲调性、功能品质等做进一步探究。

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The Application of Aqueous Enzymatic Technology on Preparation of Cashew Nut Protein

GAO Lin，ZHU Xiao-tian，DENG Jing-jing，LIANG Yu，WU Ji-hong*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agriculture University，National Engineering Research Center for Fruits and Vegetables Processing，Key Laboratory of Ministry of Agriculture Vegetables，Beijing 100083，China）

The cold-pressed technique and low temperature was used to solvent extraction technology to remove oil.Then，the defatted cashew nut（contains 2.99%oil and 34.61%protein）was used to extract crude protein by aqueous enzymatic method.During the process of its extraction，the effect of the enzyme dosage，extracting solution pH，extraction temperature，solid-to-liquid ratio and the acid precipitator pH on the purity of protein were investigated using single factor experiment and response surface experiment，the optimum conditions were obtained as follows：the 2.0%enzyme dosage，7.0 for the extracting solution pH，60°C of extraction temperature，1∶10（g/mL）of solid-to-liquid ratio and 4.5 for the acid precipitator pH，which will provide theoretical direction for the development of cashew nut products.

cashewnut；vegetableprotein；aqueousenzymatictechnology；alphaamylase；processoptimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.013

2015-10-13

公益性行业（农业）科研专项“优质高效富硒农产品关键技术研究与示范”（201303106）

高林（1988—），女（汉），博士研究生，主要从事农产品加工研究。

吴继红（1964—），女（汉），教授，博士生导师，主要从事农产品加工技术与理论研究。