阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法测定赣南脐橙中的氨基酸

王晓芬, 陈美芬， 刘俊俊， 鄢爱平， 万益群*，

(1.南昌大学化学学院，江西南昌 330031；2.南昌大学分析测试中心，江西南昌 330047)

氨基酸是含羧基和氨基的一类有机化合物的通称，是生物体内不可缺少的营养成分之一，它构成蛋白质的基本单位，参与生物体内的新陈代谢和生理过程，与生物的生命活动密切相关[1]。脐橙具有较高的营养、药用、保健价值，备受广大消费者的喜爱。氨基酸也是脐橙风味的主要组成物质。江西赣南盛产脐橙，誉称“脐橙之乡”，由于其得天独厚的土壤条件，生产的脐橙果大形正，橙红鲜艳，光洁美观，肉质脆嫩化渣，风味浓甜芳香，已得到国内外知名人士、专家和国家有关部门的高度评价和肯定，其产品已销往世界各地。而在经济利益驱使下，市场上开始出现较多的“伪赣南脐橙”，严重损害了果农及消费者的利益。脐橙中氨基酸的种类及含量与脐橙种类、产地及质量等因素密切相关。分析脐橙中氨基酸不仅可以判别脐橙的品质[2,3]，衡量其营养价值，还可以甄别其产地。目前测定氨基酸的方法主要有氨基酸自动分析仪法[4,5]、气相色谱及气相色谱-质谱联用法[6 - 8]、高效液相色谱及高效液相色谱-质谱联用法[9 - 11]、毛细管电泳法[12,13]以及离子色谱法[14,15]等。

本研究应用高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法对赣南6个县的脐橙中的氨基酸的品质进行探讨，并找出了不同区域脐橙中氨基酸种类及对应含量的差异性。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

ICS-2500型离子色谱仪(美国，Dionex公司)，包括GP50四元梯度泵、LC25色谱柱箱、ED50电化学检测器，安培检测池由金电极、Ag/AgCl参比电极和包含池体的钛对电极组成；仪器控制数据处理采用Chromeleon 6.5色谱工作站；AP210电子天平(美国，Ohaus公司)；KQ-100DE超声波清洗仪(昆山超声仪器厂)；Milli-QS超纯水器(美国，Millipore公司)。

精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)(纯度均大于99%，购于德国Sigma Aldrich公司)；NaOH溶液(纯度均大于99%，购于德国Sigma Aldrich公司)；NaOH溶液(质量分数50%～52%，德国Sigma Aldrich公司)；NaAc溶液(美国戴安公司)；聚苯乙烯-二乙烯基苯型阳离子交换树脂(PS-DVB)003x7(南开大学化工厂)；氨水、HCl、甲酸、乙醇均为分析纯；实验用水均为电阻率18.2 MΩ·cm的超纯水。

脐橙样品采自江西赣南章贡区、赣县、大余县、信丰县、安远县和崇义县。

1.2 样品处理

准确称取4.00 g的脐橙样品于50 mL离心管中，加入15 mL 70%的乙醇，于温度40 ℃下超声提取20 min，过滤。重复提取一次，合并滤液于50 mL容量瓶中，并用水定容。分别用10 mL 1 mol/L HCl 和10 mL 1 mol/L NaOH溶液反复预处理阳离子交换树脂。取2 mL处理好的树脂装入玻璃柱中(15×0.9 cm)，加入5 mL提取液，静置几分钟，使样品中的氨基酸与树脂充分结合，然后以0.1 mL/min的速度流出，再用30 mL 0.02%的甲酸以1 mL/min的速度洗脱干扰物质。最后，用10 mL 2 mol/L氨水以0.5 mL/min的速度将氨基酸洗脱下来。洗脱液收集至离心管内，于90 ℃水浴下氮吹至近干，用水溶解并定容。

1.3 仪器工作条件

色谱柱：AminoPac PA10分析柱(250×2 mm)，AminoPac PA10保护柱(50×2 mm)；柱温：35 ℃；流速：0.15 mL/min；进样体积：25 μL；淋洗液：水、NaOH溶液和NaAc溶液进行梯度淋洗。洗脱条件为：0.0～2.0 min,76%H2O,24%NaOH；2.0～8.0 min,76%～64%H2O,24%～36%NaOH；8.0～11.0 min,64%H2O,36%NaOH；11.0～18.0 min,64%～40%H2O,36%～20%NaOH,0%～40%NaAc；18.0～21.0 min,40%～44%H2O,20%～16%NaOH,40%NaAc；21.0～23.0 min,44%～14%H2O,16%NaOH,40%～70%NaAc；23.0～42.0 min,14%H2O,16%NaOH,70%NaAc；42.0～42.1 min,14%～20%H2O,16%～80%NaOH；42.1～44.1 min,20%H2O,80%NaOH；44.1～44.2 min,20%～76%H2O,80%～24%NaOH；44.2～74.0 min,76%H2O,24%NaOH。积分安培检测器波形同文献氨基酸检测波形[16]。

图1 17种氨基酸混合标准溶液色谱图(1 mg/L)Fig.1 Chromatogram of 17 amino acids standard mixture solution (1 mg/L)Peaks:1.arginine;2.lysine;3.asparagine;4.alanine;5.threonine;6.glycine;7.valine;8.serine;9.proline;10.isoleucine;11.leucine;12.methionine;13.phenylalanine;14.glutamic acid;15.aspartic acid;16.cystine;17.tyrosine.

2 结果与讨论

2.1 色谱分析条件的优化

采用了水、NaOH和NaAc溶液作为淋洗液，淋洗过程分为三个部分：首先，用NaOH溶液将弱保留氨基酸淋洗下来，然后加入NaAc溶液淋洗强保留氨基酸，最后再用NaOH溶液平衡柱子。弱保留氨基酸的灵敏度，随NaAc溶液浓度的改变很小或几乎不变，而NaAc浓度改变时，含两个羧基的氨基酸与含一个羧基的氨基酸其灵敏度的改变相差较大，可利用这一点来提高氨基酸之间的分离度，以获得理想的分离效果。通过多次实验，最终色谱淋洗条件见1.3。

在优化的梯度洗脱条件下，探讨了淋洗液流速为0.1、0.15、0.3 mL/min时对氨基酸分离效果的影响。实验发现，当流速为0.1 mL/min时，17种氨基酸完全分离，但分离时间长达43 min，且赖氨酸的响应值较低；当流速为0.3 mL/min时，氨基酸不能完全分离，例如丙氨酸和苏氨酸。流速为0.15 mL/min，17种氨基酸分离良好，且分析时间为36 min。因此，实验选择流速为0.15 mL/min进行测定。在上述优化的条件下，17种氨基酸混合标准溶液分离色谱图见图1。

2.2 提取条件的优化

2.2.1提取方法的选择探讨了直接浸取、水浴回流提取和超声辅助提取三种方法对脐橙中氨基酸的提取效果，氨基酸提取效率为：超声辅助提取>水浴回流提取>直接浸取，且由于直接浸取法耗时较长，水浴回流提取法需要较多的试剂，超声辅助提取操作简便，提取效率高，故选用超声辅助提取法提取脐橙中的氨基酸。

2.2.2提取条件的优化以脐橙为样品，对氨基酸的提取条件进行了优化实验。采用L16(44)进行正交试验，所考虑的4个因素分别为乙醇提取剂的体积分数(A)、提取温度(B)、提取时间(C)和溶剂用量(D)(表3)。按表1方式进行的16组实验中，每组实验重复3次。各组实验所得17种氨基酸的平均回收率，列于表2。比较表中K和R的数据可看出，四个因素中，乙醇提取剂的浓度影响最大，其次是提取温度、溶剂体积、提取时间。综合17种氨基酸的优化水平，最终确定优化的提取条件为A3B3C4D3，即用15 mL的70%乙醇作为提取剂在40 ℃下超声辅助提取20 min。

表1 正交试验设计因素水平表

表2 17种氨基酸的L16 (44)正交试验结果

2.3 线性方程和检出限

将氨基酸储备液配制成一系列不同浓度的混合标准工作溶液，按选定的色谱条件进行测定，以峰面积对浓度进行线性回归，结果见表3。17种氨基酸在相应浓度范围内线性良好，检出限为0.01～0.19 mg/L。

表3 17种氨基酸的线性方程及检出限

2.4 回收率和相对标准偏差

准确称取4.00 g左右脐橙匀浆，分别添加2 mg/L、8 mg/L两个水平的氨基酸混合标准溶液，按选定方法进行样品处理和检测，以峰面积计算氨基酸在2个添加水平的回收率，每个添加水平重复试验5次，方法回收率在72.5%～130.5%之间，相对标准偏差(RSD)在0.5%～10.1%之间，方法基本能满足实际样品分析。

2.5 样品的测定

应用所建立的分析方法，对采自赣南六个地区的脐橙样品进行分析，结果见表4。

表4 赣南脐橙样品中氨基酸分析结果(mg/kg,n=3)

3 结论

本文采用正交设计对脐橙样品中氨基酸的提取条件进行了优化，并用PS-DVB 003x7型阳离子交换树脂去除提取液中共存的碳水化合物，结合离子色谱-积分脉冲安培法检测了17种氨基酸，方法快速简单，无需进行柱前或柱后衍生。对赣南6个地区脐橙样品中氨基酸进行分析，结果满意。结果表明，不同产地脐橙样品中一些氨基酸的水平存在一定差异，有可能作为鉴别脐橙种植产地的一个参考指标。