T140靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路对豚鼠关节软骨Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的影响

王坤赵沣凯李彦林贾迪余洋高寰宇肖渝李龙滕闫祥甲

1昆明医科大学第一附属医院运动医学科（云南昆明650031）

2山东省枣庄市枣矿集团公司中心医院（山东枣庄277800）

T140靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路对豚鼠关节软骨Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的影响

王坤1赵沣凯2李彦林1贾迪1余洋1高寰宇1肖渝1李龙滕1闫祥甲1

1昆明医科大学第一附属医院运动医学科（云南昆明650031）

2山东省枣庄市枣矿集团公司中心医院（山东枣庄277800）

目的：明确T140体内靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路对豚鼠关节软骨Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的影响，探讨T140减缓软骨退变的作用。方法：健康9月龄雄性Hartley豚鼠36只，随机分成A、B、C三组，A组为实验组，B组为实验对照组，C组为空白对照组，每组12只。于12周时，获取膝关节软骨，采用RT-PCR法检测Ⅱ型胶原蛋白（ColⅡ）及聚集蛋白聚糖mRNA的表达；Western blot检测ColⅡ含量。结果：RT-PCR检测结果显示A组Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的mRNA表达量高于B、C组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Western blot检测结果发现A组ColⅡ含量高于B、C组（P＜0.05）。结论：T140于体内靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路，减少关节软骨Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的降解，进而减缓关节软骨的退变。

T140；SDF-1/CRCR4信号通路；Ⅱ型胶原蛋白；聚集蛋白聚糖

研究表明，基质细胞衍生因子1（stromal cell derived factor 1，SDF-1）是一种小分子趋化蛋白，在骨关节炎（osteoarthritis，OA）的发生发展过程中起关键性作用［1］。趋化因子受体4（chemokine receptor 4，CXCR4）是SDF-1唯一的受体。在膝关节内，基质细胞衍生因子（SDF-1）由滑膜组织分泌至关节腔中，CXCR4则表达于软骨细胞表面，SDF-1与CXCR4结合可启动SDF-1/CXCR4信号通路，该信号通路是引起骨关节炎（OA）的关键［2］。在软骨组织中，Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖是构成软骨基质的主要成分，Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的减少或破坏被认为是软骨退变的重要形式。

我们的前期实验中，在体外培养软骨的培养液里添加100 ng/ml的外源性SDF-1，并加入该信号通路的特异性拮抗剂T140进行拮抗，结果表明T140可体外阻断SDF-1/CXCR4信号通路，阻止软骨细胞释放MMP-3、MMP-9及MMP-13，进而减少软骨中II型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的降解［3］。本研究以豚鼠原发性骨关节炎为模型，在前期体外实验研究的基础上，进一步深入探讨T140体内靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路，观测关节软骨内II型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的表达情况，进一步探索T140延缓关节软骨退变的作用。

1　材料与方法

本实验在中国科学院昆明动物研究所完成。

1.1实验动物

取健康的9月龄雄性Hartley豚鼠（四川达硕生物公司；实验动物生产许可证号；TBA287640-334）36只，体重1.2±0.1 kg，雄性，纯化清洁级。所有实验动物的对待和照顾严格遵循《实验动物管理条例》，并经过昆明医科大学实验动物伦理委员会许可。

1.2主要实验试剂及仪器

T140冻干粉（美国Sigma公司），PBS粉（武汉博士德生物工程有限公司），RNeasy isolation kit（北京美科美佳生物科技开发有限公司），RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司，加拿大），SDF-1（Sigma公司，美国），BCA蛋白浓度测定试剂盒（天根生化）。Alzet胶囊式微量渗透压泵（上海普迈生物cellsciences公司），冰箱BCD-216AD（青岛海尔股份有限公司），Real-Time PCR仪（Applied Biosystems，美国）。

1.3实验分组及软骨组织获取

36只豚鼠随机分成3组，即实验组（A组）、实验对照组（B组）、空白对照组（C组），每组12只。A组中每只豚鼠皮下植入Alzet胶囊式微量渗透压泵，其内灌注无菌PBS液充分稀释过的T140冻干粉，T140以浓度为180 μg/ml.d泵入豚鼠皮下组织，B组中每只豚鼠皮下植入Alzet胶囊式微量渗透压泵，其内仅仅灌注PBS液，C组中各只豚鼠不做任何处理。36只豚鼠常规饲养至12周时，采用戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射法处死全部豚鼠，取下膝关节部软骨。每组所取标本随机分为两组，一组用于PCR检测，一组用于Western blot检测。

1.4检测指标

1.4.1RT-PCR检测软骨组织内Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA的表达

采用RNeasy isolation kit提取软骨组织标本中的总RNA。用紫外分光光度计分别在波长为260 nm和280 nm条件下，测定所提取RNA吸光值，以OD260/ OD280的比值来鉴定mRNA纯度，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间时说明所提取得RNA较纯，杂质少，取该比值区间的RNA进行后续实验。然后取其中的1 μg蛋白样品按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit说明书，反转录合成cDNA，以浓度为40 μg/μl的cDNA作为模板进行PCR扩增及β-Actin作为内参照。根据引物设计原则，使用primers Express software软件进行分析设计各基因引物，豚鼠内参基因β-ACTIN，上游引物：5'-CCACCATGTAC CCAGGCATT-3'，下游引物：5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'，DNA片段177 bp；豚鼠Ⅱ型胶原蛋白5'-ACATCTCAGCAGCATCATCACC-3'，5'-CATCACCACGCAGTCCTCAC-3'，DNA片段103 bp；豚鼠聚集蛋白聚糖，上游引物：5'-ACATCTCAGCAGCATCATCACC-3'，下游引物：5'-CATCACCACGCAGTCCTCAC-3'，DNA片段199 bp。循环参数：95℃5 min预变性，95℃变性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸1 min，30个循环。使用Real-Time PCR仪检测标本中各基因的表达情况，为确保数据的有效性，每个样品均平行做3个复孔。统计数据时将各组Ct值转换成2Ct后进行数据分析，分析Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖mRNA表达。

1.4.2Western Blot检测Ⅱ型胶原蛋白的水平

软骨组织中的总蛋白参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行提取，BCA法测定蛋白浓度计算上样缓冲液中应含总蛋白含量，使各组总蛋白水平相等。10 μg总蛋白在浓缩胶（6%）进行SDS-PAGE电泳30min，继续用15%分离胶将蛋白质按分子量大小分离，然后电转移至PVDF膜进行抗原抗体杂交反应。先用脱脂牛奶封闭非特异蛋白结合位点，洗涤后加入一抗，再洗涤加二抗，孵育1～2 h，在暗室内加入免疫印迹化学发光试剂（ECL Western blotting kit）曝光显影，图像分析软件（Quantity One）进行目标蛋白和β-actin的光密度测定，用目标条带与β-actin光密度比值反映蛋白相对表达量，进行组间比较。

1.5统计学分析

采用SPSS17.0软件包进行统计学分析，实验资料用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较时采用LSD检验；检验水准α=0.05，以P＜0.05为有统计学意义。

2　结果

2.1RT-PCR检测结果

II型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖和β-ACTIN内参基因引物扩增的基因片段比照扩增曲线及溶解曲线后，显示了扩增的单一性和一致性。膝关节软骨组织标本RT-PCR结果显示，II型胶原蛋白（ColⅡ）及聚集蛋白聚糖（ACAN）mRNA的表达量A组最高，明显高于B组和C组，差异有统计学意义（P＜0.01）（表1）。B组与C组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1　II型胶原蛋白（ColⅡ）及聚集蛋白聚糖（ACAN）mRNA的表达量（n=12）

2.2Ⅱ型胶原蛋白的Western blot检测

在软骨组织的蛋白水平检测中，可见II型胶原蛋白表达量A组比B、C组高，灰度最深，而B、C两组灰度值差别不明显（图1）；A组与B、C两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。这表明，T140在体内可增加软骨组织II型胶原蛋白的表达量，对骨关节炎中软骨的修复具有积极作用。

图1　T140干预对关节软骨内Ⅱ型胶原蛋白（ColⅡ）表达的影响

表2　各组II型胶原蛋白灰度值比较（n=12）

3　讨论

基质细胞衍生因子（SDF-1）是由多种细胞产生的CXC类小分子趋化蛋白，能特异性结合趋化因子受体4（CXCR4）。在膝关节中，SDF-1由滑膜产生并分泌至关节腔及血液中，趋化因子受体4（CXCR4）属于G蛋白偶联受体，表达于软骨细胞表面，是已知的SDF-1唯一的受体。SDF-1与CXCR4结合启动SDF-1/CXCR4信号通路，进而引起基质金属蛋白酶类（MMPs）的释放，通过破坏软骨细胞外基质而发生骨关节炎。所以，SDF-1/CXCR4信号通路是引起骨关节炎（OA）的关键［2］。该通路还参与很多肿瘤的增殖、转移与扩散［4，5］。故本研究中，以CXCR4为SDF-1拮抗剂（T140）治疗的靶点，通过阻断SDF-1/CXCR4信号通路，探寻T140的靶向作用，为靶向治疗OA寻找新的突破点。

由于Hartley豚鼠的原发性OA模型的病理特征与人原发性OA相似［6］，该原发性OA动物模型的组织学、生物化学及分子生物学类似人OA的变化特征［7，8］。OA病变于9月至12月最明显，OA的严重程度与蛋白多糖及胶原含量的减少相平行。钱丽萍等［9］的观点也认为，豚鼠OA的动物模型与人OA相似性最高。故本实验选用9月龄Hartley豚鼠作为原发性骨关节炎的研究模型。

胶原和聚集蛋白聚糖对维持关节软骨的弹性及硬度具有重要作用，在关节软骨退变中是主要的保护性因素。II型胶原构成纤维网架结构中的主体，聚集蛋白聚糖使软骨具有抵抗压力和分散负荷的能力。聚集蛋白聚糖的丢失往往被认为是关节炎的早期主要表现，聚集蛋白聚糖核心蛋白特定位点断裂产生的片断可在OA患者的软骨及关节液中被发现。关节软骨表面的纤维样改变与软骨基质中小分子聚集蛋白聚糖的丢失有密切关系。II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖是软骨基质中的主要成分，所以二者的表达和凋亡情况是反映软骨退变程度的最好指标。因此，本研究中，我们通过RT-PCR检测各组软骨II型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达情况，Western blotting检测软骨内II型胶原蛋白的含量，以便观测T140靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路后，软骨组织中保护性元素的变化情况。

T140是一种含14个氨基酸的能特异性结合并阻断SDF-1/CXCR4信号通路的小分子多肽，是目前发现的最强的CXCR4受体拮抗剂，T140［10］是CXCR4受体的安全拮抗剂，能有效阻止SDF-1/CXCR4信号通路，目前主要用于抗艾滋病、抗肿瘤以及抗慢性炎症疾病的靶向药物研究，但在靶向治疗OA软骨退变方面报道甚少［11］。

在我们前期关于T140干预骨关节炎的体外实验研究中［3］，通过体外培养骨关节炎软骨组织块，加入T140进行干预，发现T140可体外阻断SDF-1/CXCR4信号通路，缓解软骨细胞降解II型胶原蛋白。此次体内实验进一步发现，A组（含T140）豚鼠关节软骨内II型胶原蛋白（ColⅡ）及聚集蛋白聚糖（ACAN）mRNA表达量最高，明显高于B组和C组，差异有统计学意义。Western Blot结果显示，A组（含T140）II型胶原蛋白表达量也高于B、C两组，差异有统计学意义。分析认为，T140通过与SDF-1竞争性结合CXCR4位点，靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路，抑制了基质金属蛋白酶的释放，减少II型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的降解，进而可以延缓关节软骨退变。

综上，虽然目前在改变OA病程进展方面药物治疗基本无效［12］，但是通过靶点干预防治骨关节炎具有可能性。本研究发现，T140在体内可以靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路，减少II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的降解，在防止关节软骨退变方面有积极作用，有望成为治疗OA的有效药物。但是，本研究尚存在不足，如：Sox9基因作为转录激活因子，在软骨细胞增殖、分化及软骨形成中发挥了重要作用，加入T140干预后，如果进一步检测Sox9基因的表达变化，并且深入探讨Sox9基因与ColⅡ及SDF-1/CXCR4信号通路的关系等，可能获得更进一步的支持。

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The Effect of T140 on TypeⅡCollagen and Aggrecan in Articular Cartilage of Guinea Pigs

Wang Kun1，Zhao Fengkai2，Li Yanlin1，Jia Di1，Yu Yang1，Gao Huanyu1，Xiao Yu1，Li Longteng1，Yan Xiangjia1
1 Department of Sports Medicine，First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Yunnan，China 650031
2 Department of Osteoarthritis，Central Hospital of Shandong Zaozhuang Mining Group，Shandong，China 277800

Li Yanlin，Email：852387873@qq.com

Objective The purpose of this study is to explore the effect of T140（an antagonist of SDF-1/ CRCR4 signaling pathway）on typeⅡcollagen and aggrecan in articular cartilage of guinea pigs.Methods 36 9-month-old male healthy Hartley guinea pigs were divided into three groups：experimental group（A，n=12），experimental control group（B，n=12）and blank control group（C，n=12）.Pigs in group A were implanted Alzet capsule type micro osmotic pressure pump containing T140 diluted by PBS solution and in group B implanted the pump containing PBS solution only.Articular cartilages of knee joint were harvested for measuring mRNA levels of typeⅡcollagen and aggrecan with RT-PCR and protein levels of typeⅡcollagen with Western blot 12 weeks later.Results The mRNA levels of the typeⅡcollagen and aggrecan in group A were significantly higher than in groups B and C（P＜0.05）.The content of typeⅡcollagen in group A was also significantly higher than in groups B and C（P＜0.05）.Conclusion T140 reduces the degradation of typeⅡcollagen and aggrecan through blocking the SDF-1/CRCR4 signaling pathway and so as decreases the risk of cartilage degeneration.

T140，SDF-1/CRCR4 signaling pathway，typeⅡcollagen，aggrecan

2015.07.05

国家自然科学基金项目（编号：81460340）；云南省创新团队项目（编号：2014HC018）；云南省医学学科带头人培养项目（编号：D-201207）

李彦林，Email：852387873@qq.com