聚乙交酯丙交酯共聚物体外实时降解和加速降解的相关性研究

北京市医疗器械检验所（101111）林红赛 刘曦 于少君 黄永富 岳卫华

聚乙交酯丙交酯共聚物（PLGA）是一种重要的可降解吸收的人工合成材料，由于其良好的生物相容性，已在组织工程、骨折内固定和外科手术缝合等领域广泛应用[1][2]。体外降解试验是评价这类材料的关键项目之一，体外降解试验可以预估材料在体内降解的行为，在进行体内降解试验之前先进行体外降解试验可节约大量的试验成本。

体外降解试验一般可分为体外实时降解试验和体外加速降解试验[3]，体外实时降解试验是模拟体内降解试验的常用方法，但由于体外实时降解周期较长，不适合用于降解周期较长的样品，尤其是当体外降解试验用于评价样品的均一性和稳定性时，大量开展体外实时降解试验费时费力。因此，本研究旨在探讨加速降解和实时降解的关联性，选用医疗器械产品中常用的PLGA材料，同时进行体外实时降解和加速降解试验，从抗张强度试验、质量损失、特性黏度和降解产物测定四个方面进行实时降解和加速降解的测试，并分析实时降解和加速降解的试验结果，建立数学模型，考察实时降解和加速降解可能存在的相关性。

附表 PLGA样品实时降解和加速降解的抗张强度试验结果

1 材料和方法

1.1 试剂与设备 PLGA样品（PLGA钉子，其组成为丙交酯:乙交酯=60∶40，由国内某厂商提供）；乳酸标准品（Dr. Ehrenstorfer公司生产）；乙醇酸标准品（Dr. Ehrenstorfer公司生产）；六氟异丙醇（分析纯）；磷酸二氢钾（分析纯）；二水合磷酸氢二钠（分析纯）；实验用水为超纯水。

电子天平（精度：0.0001g，梅特勒－托利多公司）；配紫外检测器的高效液相色谱仪（Waters公司）；万能材料试验机（INSTRON公司）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 Sorensen缓冲液的配制[2]Sorensen缓冲液：由18.2%（体积分数）的1/15mol/L磷酸二氢钾和81.8%（体积分数）的1/15mol/L磷酸氢二钠混合而成，pH值约为7.50。1/15mol/L磷酸二氢钾：称取9.078g磷酸二氢钾，加水溶解并定容至1L容量瓶中。1/15mol/L磷酸氢二钠：称取11.876g二水合磷酸氢二钠，加水溶解并定容至1L容量瓶中。

1.3 温度的选择 参考标准GB/T 16886.13-2001[3]和YY/T 0473-2004[4]，实时降解试验选用37℃±1℃的生理温度，标准中建议加速降解选用高于37℃并低于材料的熔化或软化的温度范围的某一个温度下进行试验。故本试验通过差式扫描量热仪测试PLGA样品的玻璃化转变温度以进行温度的选择。

1.4 样品的制备 参考行业标准YY/T 0473-2004进行降解试验。PLGA样品与Sorensen缓冲液浸提比例为500∶1（g∶mL），分别于37℃放置2天、3天、7天、14天、28天、35天、56天、63天和112天，50℃放置2天、4天、6天、8天、10天、14天、18天、21天、28天、35天和42天，到指定时间点后，分离样品和降解液，每个时间点平行制备5份样品。

1.5 抗张强度测试 取按1.4制备的样品，取出降解后的样品，用线将样品的两端固定，进行抗张强度测试，机头加力速度：25mm/min，上下夹具之间的距离约为80mm。

1.6 质量损失的测定 降解前称量样品的质量W0，然后按1.4浸泡样品，通过过滤分离样品和降解液，用超纯水清洗样品5～6遍，于真空干燥箱中干燥至恒重得到降解后样品质量Wt，质量损失百分比计算公式为：(W0-Wt)/W0×100%。

1.7 特性黏度的测定 取按1.4制备的样品，通过过滤分离样品和降解液，用超纯水清洗样品5～6遍，于真空干燥箱中干燥至恒重后，精密称取50mg干燥后的样品，用六氟异丙醇溶解并定容至50mL，3号垂熔漏斗过滤后，于25℃条件下，用乌氏黏度计测定。

1.8 降解产物测定 取分离后的降解液，用磷酸调节pH值至2.8，用流动相稀释1～50倍后，0.45μm滤膜过滤，进样分别测定降解产物中乙醇酸和乳酸的含量。色谱条件如下：Synergi Hydro-RP 80A C18色谱柱（250mm×4.6mm）；流动相为20mmol/LKH2PO4；流速0.6mL/min；柱温30℃；紫外检测器，检测波长210nm；进样量20μL。

2 结果

2.1 温度的选择 差式扫描量热法测得PLGA样品的玻璃化转变温度为52.8℃，故本试验选择了50℃±1℃作为加速降解的试验温度。

2.2 抗张强度试验 PLGA样品在37℃和50℃的抗张强度试验结果见附表。50℃的样品降解2天后轻微施加外力样品即碎裂，所以50℃时样品降解速率过快不易进行抗张强度试验，故无法获得抗张强度试验结果。

2.3 质量损失 PLGA样品在37℃和50℃下的质量损失百分比结果见附图1，由附图1可知，50℃的样品降解速率明显大于37℃的，经曲线拟合得到不同温度下质量损失几乎呈线性相关关系。37℃的曲线拟合方程：y=0.830x-5.321，R²=0.97，R²=0.98，50℃的曲线拟合方程：y=3.280x+5.222，R²=0.92。由曲线拟合的斜率可初步推断，50℃的降解速率约是37℃降解速率的4倍。

2.4 特性黏度 测试PLGA样品在37℃和50℃两个不同温度下的特性黏度。各个降解时间点的特性黏度值ηt比上降解前样品的特性黏度η0，计算公式为：ηt/η0×100%，以ηt/η0%为横坐标，时间天数为纵坐标，结果见附图2，由附图2可见，37℃和50℃的ηt/η0%与时间的关系图均呈现对数相关关系。因此，取ηt/η0%的对数即ln(ηt/η0%)，以ln(ηt/η0%)为纵坐标，时间天数为横坐标，绘制曲线图，见附图3，经曲线拟合得到不同温度下ln(ηt/η0%)与时间几乎呈线性相关关系。37℃条件下曲线方程为：ln(ηt/η0%)=-0.043x+4.568，R²=0.99；50℃条件下曲线方程为：ln(ηt/η0%)=-0.151x+4.392，R²=0.97。由拟合曲线斜率可初步推断，50℃的降解速率是37℃降解速率的3.5倍。

2.5 降解产物的测定结果 乙醇酸和乳酸的方法验证结果：降解液中乙醇酸的线性范围为2.500μg/mL～250.0μg/mL（r=0.9999），定量限为0.48μg/mL，加标回收率为99.4%～102.6%，乙醇酸峰面积的RSD为0.5%（n=6）；降解液中乳酸的线性范围为2.642μg/mL～264.2μg/mL（r=0.9999），定量限为1.0μg/mL，加标回收率为97.9%～103.2%，乳酸峰面积的RSD为0.1%（n=6）。

附图1 PLGA样品实时降解和加速降解的质量损失百分比比较

附图2 PLGA样品实时降解和加速降解的ηt/η0%比较

附图3 PLGA样品实时降解和加速降解的ln(ηt/η0%)比较

附图4 PLGA样品实时降解和加速降解的乙醇酸含量比较

附图5 PLGA样品实时降解和加速降解的乳酸含量比较

将不同时间点的样品稀释1～50倍后进样测得的浓度值与浸提液的体积相乘，折算成降解液中乙醇酸和乳酸的绝对含量。由附图4和附图5可知，50℃的试验条件下，在降解第10天到21天之间，乙醇酸和乳酸的含量显著增加，降解约28天后，乙醇酸和乳酸的含量几乎趋于稳定；37℃的试验条件下，在降解第28天到63天之间，乙醇酸和乳酸的含量显著增加，降解约63天以后，乙醇酸和乳酸的含量几乎趋于稳定。

3 讨论

据文献报道[5-8]，PLGA材料的降解为均相降解，降解过程主要分为三个过程，分别是PLGA的吸水、酯键的水解断裂和可溶性低聚物的扩散溶解。体外加速降解和实时降解都经历这三个过程，当样品接触缓冲溶液时，首先发生吸水溶胀现象，然后逐步发生酯键的水解断裂，该阶段大约发生在实时降解过程的7天后（加速降解约在2天后），此时样品由高聚物断裂成中度聚合物，故样品的特性黏度明显减小，但样品外观形态和质量损失并没有明显的改变。当实时降解约28天后（加速降解约在2天后），样品质量损失开始明显增加，当实时降解约28天后（加速降解约在10天后），降解液中降解产物乙醇酸和乳酸的含量开始明显增加。加速降解试验三个阶段可能不是很明显，尤其是溶胀和酯键水解发生的很快，但通过质量损失百分比和特性黏度百分比的对数的曲线拟合斜率可知，加速降解速率约是实时降解速率的3.5～4倍。因此，选用加速降解试验替代实时降解试验具有一定的可能性，并缩短将近四分之三的试验时间，尤其适用于降解周期较长的PLGA样品的降解试验的开展。但是，PLGA材料的降解受多种因素的影响，如分子量、结构组成和工艺等，因此不同来源的PLGA材料的加速降解和实时降解的倍比关系可能不同。

4 结论

本试验结果表明，PLGA样品（丙交酯∶乙交酯=60∶40）的加速降解和实时降解存在一定的相关性，本试验条件下发现，PLGA的加速降解速率约是实时降解速率的3.5～4倍。