芦笋三种花蕾性别分化相关差异蛋白表达分析

刘 孟，乜兰春，王珊珊，胡淑明



芦笋三种花蕾性别分化相关差异蛋白表达分析

刘 孟，乜兰春，王珊珊，胡淑明

（河北农业大学园艺学院，河北保定 071001）

【目的】探究与芦笋性别分化相关的蛋白，为揭示性别分化的分子机制奠定基础。【方法】以芦笋雌株、雄株、雄性两性株两性分化期的花蕾为材料，采用双向电泳、质谱鉴定和生物信息学相结合的方法，对其进行蛋白质差异表达分析。【结果】通过双向电泳3次重复试验发现，雌、雄花蕾相比，雄花蕾特异蛋白点25个，上调蛋白点5个；雌花蕾特异蛋白点13个，上调蛋白点12个；雄性两性花蕾与雄花蕾相比，特异蛋白点19个，上调蛋白点8个。经过质谱鉴定及生物信息学分析，鉴定出雄花蕾特异或上调表达同源蛋白6个，包括1个促进α淀粉酶合成的luminal binding protein（BiP）；3个参与糖代谢的蛋白，分别为β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和胞质磷酸甘油酸激酶；1个与质体相关的脂连接蛋白PAP fibrillin和1个未知功能的Os02g0634900蛋白；雄性两性花蕾和雌花蕾特异或上调表达同源蛋白16个，包括2个参与糖酵解过程的蛋白，即烯醇化酶1和胞质磷酸甘油酸激酶；2个维持细胞结构的蛋白，即肌动蛋白亚型B和肌动蛋白；2个参与能量代谢的蛋白，即ATP合成酶CF1α亚基和ATP合成酶β亚基；2个参与细胞内物质运输的蛋白，即小GTP结合蛋白和GTP结合蛋白，1个抑制蛋白质合成的核糖体失活蛋白，1个参与物质运输和信号转导的蛋白，即ADP核糖激化因子相似蛋白，1个催化磷酸基团转移的蛋白，即核苷二磷酸激酶，1个脂质相关蛋白，1个与光合作用（光系统Ⅱ）有关的蛋白，即放氧增强蛋白1，1个允许离子、糖和氨基酸被动转运穿过外膜的蛋白，即细胞外膜孔道蛋白，2个未知功能的蛋白，即细胞内病程相关蛋白亚型4和假想蛋白。【结论】β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、胞质磷酸甘油酸激酶、luminal binding protein (BiP)、PAP fibrillin和Os02g0634900在芦笋上的同源蛋白与芦笋雄性器官发育相关；烯醇化酶1、胞质磷酸甘油酸激酶、肌动蛋白亚型B、肌动蛋白、ATP合成酶CF1α亚基、小GTP结合蛋白、GTP结合蛋白、核糖体失活蛋白、ADP核糖激化因子相似蛋白、核苷二磷酸激酶、脂质相关蛋白、放氧增强蛋白1、细胞外膜孔道蛋白和假想蛋白在芦笋上的同源蛋白，ATP合成酶β亚基、细胞内病程相关蛋白亚型4与芦笋雌性器官发育相关。放氧增强蛋白1和细胞外膜孔道蛋白在芦笋上的同源蛋白可能为雌性器官发育的关键蛋白。

芦笋；雌花蕾；雄花蕾；雄性两性花蕾；性别分化；差异蛋白

0 引言

【研究意义】芦笋（L.），又名石刁柏，是百合科天门冬属宿根性多年生草本植物，具有较高的营养和保健价值[1-3]。芦笋雌雄异株，其性别分化先经历“两性”时期，之后在特定阶段，性器官选择性发育。但也有极少数雄株花的雌性器官发育完全，为雄性两性株[4-6]。芦笋性别由1对等位基因决定，Mm为雄株（包括雄性两性株），mm为雌株[7-9]，其中雄株产量高，经济寿命长[10-11]。雄性两性株（Mm）及其自交后代超雄株（MM）是芦笋遗传研究及全雄育种的重要种质材料。但自然条件下，雄性两性株出现的比例极低，加之田间筛选困难，芦笋种质创新和全雄品种选育受到很大限制[6,10,12]。明确芦笋性别分化机理，将为芦笋性别调控和种质创新奠定基础，也可进一步丰富雌雄异株植物性别分化的相关理论。【前人研究进展】芦笋性别分化是由性别决定基因主导的，同时许多特异表达基因参与调控[13-17]。国内外学者已经分离并且得到与芦笋花器官发育相关的10多个特异基因，但又证实这些基因与芦笋性别决定与分化无直接关系，由于芦笋性别决定基因区域有大量重复序列，阻碍了单拷贝M位点的定位，芦笋性别决定与分化的分子机理尚未完全揭示[13]。芦笋性别分化的基因调控是复杂的，采用转录子组和蛋白质组技术是识别这些基因的有效方法。基因表达的直接产物是蛋白质，蛋白质通过其自身特异的活动控制和调节生命活动[18]。在性别分化过程中，蛋白质的差异在一定程度上可以反映基因对于花发育的调控[19]，对蛋白质组学及差异蛋白质研究可从植物本身的代谢活动方面更清晰地揭示植物性别分化的机理。【本研究切入点】目前，在文冠果[19]、苦瓜[20]、黄瓜[21]、果梅[22]等植物上已研究发现了与其性别分化相关的特异蛋白，但大部分停留在检测其分子量方面，有关芦笋性别分化相关蛋白的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】本试验利用双向电泳和质谱鉴定技术对芦笋雌株、雄株和雄性两性株进入两性分化期的花蕾可溶性蛋白进行分离和鉴定，结合生物信息学分析，确定其功能，以期找出与芦笋性别分化有关的蛋白，为揭示性别分化的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

蛋白质样品制备、双向电泳及图谱分析和质谱鉴定于2015年6—8月在北京华大蛋白技术有限公司实验室进行。

1.1 供试材料

材料为3年生芦笋品种‘冠军’，采自河北农业大学农林试验基地。2015年春季萌芽后，嫩茎侧枝展开，根据形态学和解剖学观察[23]，分别取雌株、雄株、雄性两性株上进入两性分化期的花蕾液氮速冻，-80℃冰箱保存。

1.2 差异蛋白分析

1.2.1 蛋白质样品制备 分别取适量花蕾加入10% PVPP和液氮进行研磨，将磨细后的粉末放入离心管中，加入10% TCA的预冷丙酮，-20℃沉淀2 h，在4℃下20 000×离心30 min，弃上清；再加入预冷的纯丙酮，清洗沉淀，振荡后于-20℃沉淀30 min，重复清洗3次，除去丙酮后，加入终浓度为1 mmol·L-1PMSF，2 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1DTT的L3裂解液500 μL，冰浴超声5 min，最后在15℃，20 000×条件下离心30 min，收集上清保存于-80℃冰箱备用。使用2-D Quant-kit法对蛋白进行定量。

1.2.2 双向电泳及图谱分析 采用18 cm、pH为4—7的线性IPG胶条，上样量500 μg。等电聚焦电压设置为：水化12 h，然后依次经过50 v 2 h、500 v 2 h、1 000 v 2 h，最终稳定在8 000 v，最后总电压时间积为110 000 vh。等电聚焦结束后将胶条移至平衡槽中，在胶条平衡缓冲液中平衡15 min，然后进行第二向SDS-PAGE电泳。在50 mA/gel、20℃条件下电泳至溴酚蓝指示剂跑出胶底。用纯水冲去电泳液，倒入考染液，室温染色1 h，然后倒入考染脱色液，室温脱色至背景透明，使用UMAXPowerLook 2100xl扫描仪扫描双向电泳凝胶并保存可用于胶图分析的TIF图，每个蛋白质样品重复3次。将扫描后胶图导入IMAGEMASTER 5.0分析软件中，分别分析每一张胶，将同一个样品的3张胶图拟合成一张虚拟胶图进行定量分析，得出3倍以上差异点和特异点列表。

1.2.3 差异蛋白质质谱检测 使用液相二级质谱（LC-MS-MS）检测，得到肽指纹图谱、肽段长度、分子量等参数，基于这些参数进行mascot搜索，得到与其匹配的蛋白。数据库选择NCBInr，种属选择Green Plants，氨基酸固定修饰方式选择“Carbamidomethyl (C)”修饰，可变的修饰方式选择“Gln->pyro-Glu (N-term Q)，Oxidation (M)”修饰，选取单同位素峰检索，可接受的肽段分子量误差设为15 ppm。

2 结果

2.1 芦笋雌花蕾、雄花蕾与雄性两性花蕾的双向电泳图谱分析

3种花蕾全蛋白双向电泳后，得到电泳图（图1）。雌、雄花蕾相比，雄花蕾特异蛋白点25个，分子量主要在12—59 kD，pI主要在5.5—8.0，上调蛋白点5个（点43、48、58、155、233），分子量分别为16 kD、16 kD、17 kD、32 kD和43 kD，pI分别为6.0、5.8、5.8、8.4、7.5；雌花蕾特异蛋白点13个，分子量主要在21—39 kD，pI主要在4.9—6.9，上调蛋白点12个(点67、72、84、105、122、162、167、169、193、269、273、276)，分子量主要在15—56 kD，pI主要在5.4—6.3（表1）。雄性两性花蕾与雄花蕾相比，雄性两性花蕾特异蛋白点19个，分子量主要在11—33 kD，pI主要在5.0—6.4，上调蛋白点8个（点29、47、108、113、116、173、181、195），分子量主要在20—33 kD，pI主要在5.6—6.0（表2）。

用IMAGEMASTER 5.0软件分析，得到3种花蕾的差异蛋白点电泳图，如图2。将上述雌、雄花蕾相比，雄花蕾特异且占全部蛋白量比例大于0.11%的15个蛋白点（点18、24、26、37、38、54、72、133、134、154、161、164、206、211、237）和上调量大于7.3倍的4个蛋白点（点43、48、58、233）；雌花蕾特异且占全部蛋白量比例大于0.20的8个蛋白点（点7、53、60、92、106、180、274、275）和上调量大于4.4倍的5个蛋白点（点84、167、169、273、276）；雄性两性花蕾和雄花蕾相比，雄性两性花蕾特异且占全部蛋白量比例大于0.30%的10个蛋白点（点59、63、64、69、71、72、79、82、175、195）和上调量大于4.3倍的4个蛋白点（点29、47、113、116）进行质谱鉴定。

2.2 差异蛋白质的质谱鉴定和生物信息学分析

对差异表达蛋白点进行质谱鉴定。结果见表3。从表3可以看出，雄花蕾15个特异蛋白点中，鉴定出1种蛋白即早期开花蛋白（点54、211）和8种芦笋同源蛋白，分别为ATP合成酶CF1α亚基（点18）、ATP合成酶β亚基（点161、206）、β淀粉酶（点24、26、37、38、72）、核糖体失活蛋白（点164）、胞质磷酸甘油酸激酶（点237）、luminal binding protein (BiP)（点134）、PAP fibrillin（点154）和Os02g0634900（点133）。由于蛋白质的翻译后修饰在双向电泳中很容易显示出来，因此可能会造成在凝胶上不同蛋白点被鉴定为同一蛋白质的现象，称为重复点（multiple spots）。雄花蕾4个上调蛋白点中，共鉴定出3种芦笋同源蛋白，分别为β淀粉酶（点43、58）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（点48）和胞质磷酸甘油酸激酶（点233）。雌花蕾8个特异蛋白点中，共鉴定出3种蛋白，即细胞内病程相关蛋白亚型4（点53）、早期开花蛋白1（点60）和ATP合成酶β亚基（点274）；5种芦笋同源蛋白，分别为细胞外膜孔道蛋白（点7）、放氧增强蛋白1（点180）、ATP合成酶β亚基（275）、ADP核糖基化因子相似蛋白（点92）和登录号为gi|61968970、序列覆盖率为38.4%认定为磷酸甘油酸激酶的蛋白（点106）。雌花蕾5个上调蛋白点中，共鉴定出1种蛋白，即ATP合成酶β亚基（点276）；4种芦笋同源蛋白，分别为烯醇化酶1（点84）、核糖体失活蛋白（点167）、肌动蛋白亚型B（点169）和ATP合成酶CF1α亚基（点173）。其中ATP合成酶CF1α亚基、ATP合成酶β亚基、β淀粉酶、早期开花蛋白1、核糖体失活蛋白和胞质磷酸甘油酸激酶在雌雄花蕾特异或上调同源蛋白中均存在。因此，雌、雄花蕾相比，luminal binding protein（BiP）、PAP fibrillin和Os02g0634900为芦笋雄花蕾特异表达同源蛋白，β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和胞质磷酸甘油酸激酶为雄花蕾上调表达同源蛋白。而细胞外膜孔道蛋白、细胞内病程相关蛋白亚型4、放氧增强蛋白1和ADP核糖基化因子相似蛋白为芦笋雌花蕾特异表达同源蛋白，烯醇化酶1、核糖体失活蛋白、肌动蛋白亚型B、ATP合成酶CF1α亚基和ATP合成酶β亚基为雌花蕾上调表达同源蛋白。

a、b、c为雌花蕾双向电泳标准图谱，d、e、f为雄花蕾双向电泳标准图谱，g、h、i为雄性两性花蕾双向电泳标准图谱

表1 雌花蕾与雄花蕾差异表达蛋白点

表2 雄性两性花蕾与雄花蕾差异表达蛋白点

从左到右依次为雌花蕾、雄花蕾和雄性两性花蕾差异显著表达蛋白点图

表3 3种花蕾质谱鉴定结果

雄性两性花蕾10个特异蛋白点中，共鉴定出1种蛋白，即早期开花蛋白1（点71）；8种芦笋同源蛋白，分别为核苷二磷酸激酶（点59）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（点63、64）、ATP合成酶α亚基（点69）、脂质相关蛋白（点72）、β淀粉酶（点79）、假想蛋白（点82）、肌动蛋白（点175）和放氧增强蛋白1（点195）。4个上调蛋白点中共鉴定出4种芦笋同源蛋白，分别为细胞外膜孔道蛋白（点29）、小GTP结合蛋白（点47）、GTP结合蛋白（点113）和磷酸甘油酸激酶（点116）。其中早期开花蛋白1、3-磷酸甘油醛脱氢酶、ATP合成酶α亚基和β淀粉酶在雄花蕾特异或上调同源蛋白中均存在。因此，与雄花蕾相比，核苷二磷酸激酶、脂质相关蛋白、假想蛋白、肌动蛋白和放氧增强蛋白1为芦笋雄性两性花蕾特异表达同源蛋白；小GTP结合蛋白、GTP结合蛋白、细胞外膜孔道蛋白和磷酸甘油酸激酶为雄性两性花蕾上调表达同源蛋白。其中放氧增强蛋白1和细胞外膜孔道蛋白同时出现在雌花蕾和雄性两性花蕾的特异或上调表达同源蛋白中，可能为芦笋雌性器官发育的关键蛋白。

3 讨论

关于植物性别分化特异蛋白的研究已有很多报道，但大多停留在检测条带差异性与分子量上[24-28]。本研究利用双向电泳、质谱鉴定和生物信息学分析相结合的技术方法，研究了芦笋雌株、雄株和雄性两性株进入两性分化期的花蕾的差异蛋白，经质谱鉴定和生物信息学分析，发现芦笋同源蛋白luminal binding protein（BiP）、PAP fibrillin和Os02g0634900在雄花蕾中特异表达，β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和胞质磷酸甘油酸激酶在雄花蕾中上调表达，它们可能与芦笋雄性器官选择性发育相关。其中luminal binding protein是一种分子伴侣，其过表达有助于α淀粉酶合成[29]。PAP fibrillin是由核基因编码，与质体相关的脂连接蛋白[30]。Os02g0634900功能尚未见报道。β淀粉酶可将直链淀粉分解成麦芽糖，3-磷酸甘油醛脱氢酶和胞质磷酸甘油酸激酶参与糖酵解中的放能阶段。可见，芦笋雄性器官选择性发育需要大量可溶性糖和更多的能量物质，所以β淀粉酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶和胞质磷酸甘油酸激酶表达量增加。王学德[31]研究表明，棉花花药内雄性细胞生长发育对碳水化合物等营养物质的需求可促进淀粉酶基因的表达和活性的提高，本研究结果与其结论一致。

本研究发现，与雄花蕾相比，在芦笋雌花蕾和雄性两性花蕾中特异表达或上调表达的同源蛋白有16个。其中芦笋同源蛋白细胞外膜孔道蛋白、细胞内病程相关蛋白亚型4、放氧增强蛋白1和ADP核糖基化因子相似蛋白在雌花蕾中特异表达；烯醇化酶1、核糖体失活蛋白、肌动蛋白亚型B、ATP合成酶CF1α亚基和ATP合成酶β亚基在雌花蕾中上调表达。核苷二磷酸激酶、脂质相关蛋白、假想蛋白、肌动蛋白和放氧增强蛋白1在雄性两性花蕾中特异表达、小GTP结合蛋白、GTP结合蛋白、细胞外膜孔道蛋白和磷酸甘油酸激酶在雄性两性花蕾中上调表达。它们都有可能与芦笋雌性器官的选择性发育有关。放氧增强蛋白1和细胞外膜孔道蛋白同时出现在雌花蕾和雄性两性花蕾的特异或上调表达同源蛋白中，可能为芦笋雌性器官发育的关键蛋白。细胞外膜孔道蛋白参与离子，糖和氨基酸被动转运穿过外膜。放氧增强蛋白1是与光合作用（光系统Ⅱ）有关的蛋白。另外，芦笋同源蛋白肌动蛋白亚型B在雌花蕾中的表达量为雄花蕾的4.5倍，肌动蛋白为雄两性花蕾的特异蛋白，表明肌动蛋白可能在芦笋雌性器官发育过程中发挥重要作用。肌动蛋白在形成细胞骨架结构，维持细胞形态等方面具有重要作用。这与胡青[19]报道的文冠果子房膨大，胚珠发育成熟，需要细胞壁具有较强的延展性，以维持细胞结构的研究结果一致。

烯醇化酶1和磷酸甘油酸激酶参与糖酵解过程。但Ucker等[32]报道，过量表达的烯醇化酶1也可能是细胞凋亡的早期表现。在凋亡细胞中，烯醇化酶1失去了糖酵解酶的活性，作为纤溶酶原受体参与调控细胞凋亡的过程[33]。芦笋雌花蕾中同源蛋白烯醇化酶1表达量增加，也可能与雌花蕾中的雄性生殖细胞的凋亡有关。ATP合成酶α亚基和ATP合成酶β亚基参与ATP的合成。核苷二磷酸激酶可以维持NDP和NTP代谢平衡，参与植物细胞的生长与分化，光敏色素A和氧化胁迫相应中的信号转导等生命活动[34]。GTP结合蛋白参与细胞通讯，核糖体与内质网结合，小泡运输，蛋白质合成等；小GTP结合蛋白在细胞内物质的运输过程中起重要作用；核糖体失活蛋白抑制蛋白质的合成；脂质相关蛋白参与脂质合成。细胞内病程相关蛋白亚型4，假想蛋白功能尚未见报道。它们与芦笋雌性器官发育的关系尚有待进一步研究。

从本研究鉴定出的蛋白及其功能来看，涉及光合作用、糖酵解、能量代谢、维持细胞结构、物质运输、信号转导、蛋白质和脂质合成等过程的多种蛋白。性别分化是一个复杂的过程，尚需对这些蛋白质进行纯化，制作探针，用于性别分化基因的定位研究。

4 结论

芦笋雄性器官发育涉及糖代谢、α淀粉酶合成、质体相关和未知功能的蛋白等4类芦笋同源蛋白，包括3种参与糖代谢的蛋白，分别为β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和胞质磷酸甘油酸激酶；1种促进α淀粉酶合成的蛋白，即luminal binding protein（BiP）；1种质体相关蛋白即PAP fibrillin和1种未知功能的蛋白Os02g0634900。雌性器官发育涉及糖酵解过程、维持细胞结构、能量代谢、细胞内物质运输、蛋白质合成、信号转导、催化磷酸基团转移、脂质代谢、光合作用过程和未知功能的蛋白等10类芦笋同源蛋白，包括2种参与糖酵解过程的蛋白，分别为烯醇化酶1和胞质磷酸甘油酸激酶；2种维持细胞结构的蛋白，分别为肌动蛋白亚型B和肌动蛋白；2种与能量代谢有关的蛋白，分别为ATP合成酶CF1α亚基和ATP合成酶β亚基；3种与细胞内物质运输有关的蛋白，分别为小GTP结合蛋白、GTP结合蛋白和细胞外膜孔道蛋白；1种与蛋白质合成有关的蛋白，即核糖体失活蛋白；1种与信号转导有关的蛋白，即ADP核糖激化因子相似蛋白；1种催化磷酸基团转移的蛋白，即核苷二磷酸激酶；1种参与脂质代谢的蛋白，即脂质相关蛋白；1种参与光合作用过程的蛋白，即放氧增强蛋白1；2种未知功能的蛋白，分别为细胞内病程相关蛋白亚型4和假想蛋白。放氧增强蛋白1和细胞外膜孔道蛋白可能为芦笋雌性器官发育的关键同源蛋白。

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（责任编辑 赵伶俐）

Expression Analysis of Differential Proteins in Three Kinds of Flower Buds with Sex Differentiation of Asparagus

LIU Meng, NIE Lan-chun, WANG Shan-shan, HU Shu-ming

(College of Horticulture, Agriculture University of Hebei, Baoding 071000, Hebei)

【Objective】 To investigate the proteins which are related to the sex differentiation, and lay a foundation for revealing the molecular mechanism of sex differentiation inL. 【Method】Differential proteins were analyzed in female flower buds, male flower buds and hermaphroditic flower buds at hermaphroditic differentiation stage by 2-D electrophoresis, mass spectrometry and bioinformatics method. 【Result】Compared male and female flower buds, 25 specific protein spots and 5 up-regulated protein spots were detected in male flower buds, 13 specific protein spots and 12 up-regulated protein spots were detected in female flower buds. Compared with male flower buds, 19 specific protein spots and 8 up-regulated protein spots were detected in hermaphroditic flower buds. The proteins were identified by LC-MS-MS and analyzed through bioinformatics. Six specific or up-regulated homologous proteins ofwere identified in male flower buds, including luminal binding protein (BiP) which promoted the synthesis of alpha amylase; beta-amylase, glyceraldehyde-3-phosphate and cytosolic phosphoglycerate kinase which are all involved in the glycolytic pathway, PAP fibrillin which is associated with liposomes,Os02g0634900 which its function is unknown. There were 16 specific or up-regulated homologous proteins ofwere identified in hermaphroditic and female flower buds, including enolase 1 and cytosolic phospho-glycerate kinase which are involved in the glycolytic pathway, actin isoform B and actin which maintained cell structure, ATP synthase CF1 alpha subunit and ATP synthase beta subunit which participated in energy metabolism;small GTP-binding protein and GTP-binding protein which participated in material transportation, ribosome inactivating protein RIPm which depressed protein synthesis, ADP-ribosylation factor which participated in material transportation and signal transduction, nucleoside diphosphate kinase which catalyzed phosphate group transfer, plastid-lipid-associated protein which participated in lipid metabolism,oxygen-evolving enhancer protein 1 which was related to photosynthesis, porin which allowed ions, sugars and amino acids across the outer membrane, intracellular pathogenesis-related protein isoform 4 and hypothetical protein which their functions are unknown.【Conclusion】Beta-amylase,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, cytosolic phosphoglycerate kinase, luminal binding protein (BiP), PAP fibrillin and Os02g0634900 which are homologous proteins ofare related to the male organ development. Enolase 1, cytosolic phosphoglycerate kinase, actin isoform B, actin, ATP synthase CF1 alpha subunit, small GTP-binding protein, GTP-binding protein, ribosome inactivating protein RIPm, with strong similarity to ADP-ribosylation factor, nucleoside diphosphate kinase, plastid-lipid-associated protein, oxygen-evolving enhancer protein 1, porin and hypothetical protein which are homologous proteins of, ATP synthase beta subunit and intracellular pathogenesis-related protein isoform 4 are related to the female organ development. Oxygen-evolving enhancer protein 1 and porin which are homologous proteins ofmight be the key proteins of female organ’s development.

; female flower buds; male flower buds; hermaphroditic flower buds; sex differentiation; differential proteins

2016-04-15；接受日期：2016-08-25

河北省自然科学基金（C2012204065）

联系方式：刘孟，Tel：15933589812；E-mail：hbndsclm10@163.com。通信作者乜兰春，Tel：13784960296；E-mail：nlch66@126.com