腹腔氢气和饱和氢盐水对家兔心肌缺血再灌注损伤及超微结构的影响

牟春平，刘云宝，邹永伟，王文凯，杨文文



腹腔氢气和饱和氢盐水对家兔心肌缺血再灌注损伤及超微结构的影响

牟春平1，刘云宝2，邹永伟1，王文凯1，杨文文1

目的 探讨腹腔氢气和静脉饱和氢盐水对家兔心肌缺血/再灌注损伤及心肌超微结构的影响。方法将40 只家兔麻醉开胸随机分为假手术组(A组)、模型对照组(B组)、腹腔氢气组(C组)和饱和氢盐水组(B组)各10只。假手术组冠脉穿线不结扎，余3组冠脉结扎60 min后再灌注同时，B组5只腹腔氧气10 mL/kg一次性注入，5只静脉生理盐水10 mL/kg10 min泵入，C组腹腔氢气10 mL/kg10 min注入；D组静脉饱和氢盐水10 mL/kg泵入。B组、C组D组均再灌480 min。结果A组、C组、D组超氧化物歧化酶(SOD)明显高于B组，但A组、C组、D组间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)；A组、C组、D组抑制羟自由基能力明显大于B组。电镜和Tunnul监测显示：A组、C组、D组细胞凋亡数明显少于B组，心肌结构相对完整，线粒体细胞核损伤较小，仅见少量溶酶体无自噬体，而B组心肌组织破坏严重细胞膜线粒体脊融合断裂较重，形成空泡部分溶酶体空泡形成，可见多个自噬体。结论两种给氢方法均能保护缺血再灌注损伤，这种保护作用与H2清除自由基抗炎、抗凋亡有关。腹腔氢气较静脉氢盐水应用方便效果更佳。

心肌缺血再灌损伤；腹腔氢气；饱和氢盐水；自由基；氧反应激；超微结构

1　材料与方法

1．1动物分组新西兰白兔40只(浙江农业科学院提供，许可证SCXK浙江2010-0047)，体重2.5 kg±0.5 kg，雌雄不限，随机分为假手术组(A组)、模型对照组(B组)、腹腔氢气组(C组)和饱和氢盐水组(B组)各10只。

1.2心肌缺血/再灌注损伤(I/R)模型制备

1.2.1麻醉及动物模型术前禁食不限水12 h，3%戊巴比妥钠30 mg/kg，耳静脉注入，并根据麻醉深浅适当补充麻药，应用HX-10E动物呼吸机(成都泰盟公司)气管插管维持正常通气，按文献[1]报道方法开胸结扎冠脉前降支，成功60 min后松解再灌注480 min的方法复制I/R模型。

1.2.2干预方式A组开胸后冠脉穿线不结扎，其中5只腹腔氢气10 mL/kg一次注入，5只耳静脉生理盐水10 mL/kg 10 min泵入；B组再灌注同时其中5只氢气10 mL/kg腹腔注入，5只耳静脉生理盐水10 mL/kg 10 min泵入；C组10只再灌注同时立即10 mL/kg氢气腹腔一次注入；D组10只，再灌注同时立即耳静脉10 min泵入10 mL/kg饱和氢盐水。

1.3高纯氢和饱和氢盐水制备应用TM型氢气发生器(济南骏铭分析仪器有限公司提供)，电解超纯水产生纯度为99.999%，将500 mL高纯氢气无死腔注入含有300 mL生理盐水的铝铂袋中，放入0.4 kPa高压舱压溶6 h制备饱和氢盐水，H2浓度为0.77 mmol/L～0.80 mmol/L消毒备用。

1.4主要检测指标和实验仪器肿瘤坏死因子a(TNF-α)Elisa试剂盒，武汉福尔生物科技股份公司(批号L150519248)；总超氧化物歧化酶(TSOD)试剂盒，南京建成生物工程研究所(批号20150514)；羟自由基(·OH)试剂盒，南京建成生物工程研究所(批号20150517)；丙二醛(MDA)，南京建成生物工程研究所(批号20150530)；细胞凋亡，Tunle检测；电镜，TECNAI-10荷兰菲公司利浦；全波长酶标仪，Specrroplus 3840美国MD公司。以上所有测试组织和血液标本采集后均-80 ℃保存，并严格按说明书操作并记录测定数据。

2　结　果

2.1各组观察指标比较A组、C组、D组TSOD、MDA与B组相比差异有统计学意义(P<0.05～P<0.001)，但A组、C组、D组差异无统计学意义(P>0.05)。A组、C组、D组TNF-α与B组相比差异有统计学意义(P<0.05～P<0.001)；C组与D组相比差异有统计学意义(P<0.05)，表明在对抗TNF-α的作用方面，腹腔氢气优于静脉饱和氢盐水。对羟自由基抑制作用：C组和D组对抗羟自由基作用最强，与B组相比，A组、C组、D组抑制羟自由基能力差异有统计学意义(P<0.05～P<0.001)，A组、C组相比差异有统计学意义(P<0.05)，而A组与D组相比差异无统计学意义(P<0.05)。A组、C组、D组心肌凋亡与B组相比差异有统计学意义(P<0.05～P<0.001)；C组、D组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1　各组观察指标比较(±s)

2.2电镜A组心肌细胞膜、线粒体和染色体结构完整，未见溶酶体和自噬体，B组心肌细胞局部溶解、断裂、线粒体嵴融合断裂较重，形成空泡，核皱缩，溶酶体部分空泡化，数个自噬体形成；C组心肌细胞排列有序正常，线粒体结构也较正常，细胞凋亡不明显，也无自噬体形成，仅少量肌丝断裂和线粒体破坏；D组肌丝和线粒体改变也较B组明显减轻，也无明显细胞凋亡和自噬体形成。

3　讨　论

研究表明：缺血再灌注损伤可导致血管内皮损伤炎性反应和细胞凋亡，心肌微循环障碍及心功能障碍等严重后果，其发生发展与氧化应激产生的活性氧自由基(reactive oxygen species)羟自由基、超氧化氮(ONOO)等活性最强的自由基密切相关。

近几年来，众多学者对氢的医学研究涉及多学科和领域，提出氢的抗炎、抗过敏和抗凋亡作用，有研究报道不同给氢方式或量可产生不同的组织器官保护作用[2-5]，也有报道能产生相似保护作用。总之，氢医学有益作用研究的结论差异可能有多种原因：作为万能还原剂，氢可以改变大多数物质结构清除自由基，这种作用可能与剂量和失效相关[6-8]；给氢的途径、剂量、时机和生物利用度，也是影响氢疗效原因[9]。

本研究也从以下几个方面证明了氢的清除自由基、抗炎和抗凋亡作用：①无论腹腔氢气和静脉饱和氢盐水均能提高心肌超氧化物歧化酶(SOD)水平，这可能与氢直接中和或清除自由基减少SOD消耗相关，也是其抗炎、抗凋亡的主要原因；②H2对·OH自由基抑制作用和抗过氧化物作用也表明腹腔H2作用最强，饱和氢盐水次之，这是由于氢直接清除自由基减少氧化应激的直接证据；③TNF-α是炎症指标之一[10]，本研究测定数值也显示腹腔氢气和静脉饱和氢盐水明显低于模型对照组，而且腹腔氢气的值更低；④细胞凋亡和电镜检查结果也显示氢气具有减少细胞凋亡，保护心肌超微结构的作用，这种抗凋亡和保护心肌作用与氢气清除自由基、减少SOD消耗剂抗炎密切相关。

本研究证明：①腹腔氢气和静脉饱和氢盐水均能发挥对抗自由基和抗凋亡等保护心肌作用，而且由于腹腔氢气给予氢气量相对多于静脉法，其作用好于静脉应用；②腹腔氢气方式方便可靠，与静脉法相对比，对心血管血流动力学影响较小，而且氢分子为质量最轻很容易穿透细胞膜，扩散到周围的组织，不完全依赖血管系统，无论静脉输入、口服由于腹腔氢气均能发挥抗自由基、抗炎和抗凋亡作用；③迄今为止，尚不清楚哪种给氢方式更好，因而探讨对具体疾病或疾病模型的最佳给氢方式或剂量和作用机制是今后研究的主要方向。

[1]卫洪超，胡盛寿，张浩，等.急性心肌梗死动物模型标准化研究[J].中国心血管病研究，2012，10(7)：528-539.

[2]Oshawa I，Ishikawa M，Takahasik，et al.Hydrogen acts as atherapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals[J].Nat Med，2007，13(6)：688-694.

[3]Zhang Y，Liu Y， Zhang J.Saturated hydrogen Saline antenuates endotoxin-induced lung dysfunction[J].J Surg Res，2015，198：41-49.

[4]Hayashida K，Sano M，Chsawa I，et al.Inhalation of hydrogen gas reduces infarct Size in rat model of myocardial ischemia-reperfusion injury[J].Biochem Biophys Res，2008，373(1)：30-35.

[5]Yoshida A，Asanuma H，Sanada S，et al.H2mediates cardioprotection via involvements of K(ATP) channels and permeability transition in marine heart[J].J Physiol Heart Circ Physiol，2013，305(4)：H542-550.

[6]Jing L，Wang Y，Zhao XM，et al.Cardioprotectiv effect of hydrogen-rich saline on lsopreterenol induced myocardial infarction in rats[J].Heart Lung Circ，2015，24(6)：602-610.

[7]Wei R， Zhang R， Xie Y，et al.Hydrogen suppresses hypoxia/reoxygenation induced cell death in hippocampal neurons through reducing oxidative stress[J].Cell Physical Biochem，2015，38：1835-1846.

[8]Ito M，Ibi T，Ketal S.Open-label trial and randomized，double-blind，placebo-controlled，crossover trial of hydrogen-enriched water for mitochondrial and mflammatory Myopathies[J].Med Gas Res，2011，1(1)：24.

[9]Zweier JL.Measrement of Superxide derived free radicals in the reperfusion hear.Evidence for a free radical mechanism of reperfusion injury[J].J Biol Chem，1988，263：1353-1357.

[10]Sakai K，Cho S，Shibata I，et al.Inhalation of hydrogen gas preteets angamst myocardial stunning and infarction in Swine[J].Scandi Cardiovasc J，2012，46：183-188.

(本文编辑郭怀印)

1.海南省第二人民医院(海南三亚 572200)；2.清华大学第一附属医院

刘云宝，E-mail：13701186952@sina.com

R542.2R256.2

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2016．16．011

1672-1349(2016)16-1862-02

2016-05-13)