重组人脑利钠肽对阿霉素小鼠急性心肌损伤时氧化应激和炎症因子的影响

袁李礼，蒋　宇



重组人脑利钠肽对阿霉素小鼠急性心肌损伤时氧化应激和炎症因子的影响

袁李礼1，蒋宇2

目的探讨重组人脑利钠肽对阿霉素所致小鼠急性心肌损伤时氧化应激水平和炎症因子表达的影响。方法将50只昆明小鼠随机分为正常对照组(10只)、阿霉素组(20只)和rhBNP治疗组(20只)。正常对照组不做任何处理；阿霉素组单次腹腔注射阿霉素15 mg/kg；rhBNP治疗组单次腹腔注射阿霉素15 mg/kg，每间隔12 h给予新活素注射液50 μg/kg。观察48 h后小鼠心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)、白细胞介素6(IL-6)mRNA表达，以及肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、血清SOD、丙二醛(MDA)和IL-6水平变化。结果阿霉素处理后小鼠产生急性心肌损伤表现，心肌酶学指标(CK-MB、LDH)升高(P<0.05)。与阿霉素组相比，rhBNP治疗组的肌酶学指标(CK-MB、LDH)降低，心肌组织中SODmRNA表达升高，IL-6 mRNA表达降低，血清SOD活性升高，MDA含量降低，IL-6水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。 结论rhBNP注射液能够通过提高抗氧化酶活性，降低脂质过氧化，减轻炎症因子，从而减轻阿霉素所致的小鼠急性心肌损伤。

急性心肌损伤；重组人脑利钠肽；阿霉素；氧化应激；炎症

阿霉素是一种蒽环类广谱抗肿瘤药物，临床上常用于治疗恶性实体瘤及血液系统肿瘤。但其剂量依赖性心肌毒性作用限制了它的广泛应用，主要表现为不可逆的心肌损伤，最终演变成充血性心力衰竭[1]。重组人脑利钠肽(rhBNP)是一种人工合成的B型脑利钠肽，与BNP有着相同的生物学作用。大量研究表明[2-3]：rhBNP治疗心力衰竭取得了良好的临床治疗效果，已经被列入美国、欧洲以及中国心力衰竭的治疗指南[4-6]，但其是否能作为有效的药物对抗阿霉素所引起的急性心肌损伤尚不明确。本研究观察rhBNP对阿霉素所致的急性心肌损伤的影响，并进一步探讨其可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物SPF级8周龄雄性昆明小鼠50只，体重35 g±3 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.2主要实验药物和试剂阿霉素购自美国Sigma公司；rhBNP(新活素，冻干重组人脑利钠肽)购自成都诺迪康生物制药有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；白细胞介素6(IL-6)ELISA检测试剂盒购自武汉博士德有限公司；肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)采用Olympus全自动生化分析仪检测；RNA提取试剂RNAiso Plus、逆转录试剂PrimeScriptTMRT reagent Kit和实时定量PCR试剂SYBR® Premix Ex Taq购自大连Takara公司，引物序列由上海生工公司合成。

1.3动物模型及分组SFP级8周龄雄性昆明小鼠50只，随机分为3组。正常对照组(Control组)10只，不做任何处理；②阿霉素组(ADR组)20只，单次腹腔注射阿霉素15 mg/kg，每间隔12 h给予生理盐水0.5 mL。rhBNP治疗组(rhBNP组)20只，单次腹腔注射阿霉素15 mg/kg，每间隔12 h给予新活素注射液0.5 mL(50 μg/kg)。

1.4标本收集小鼠在阿霉素处理后48 h，腹腔注射5%的水合氯醛麻醉，心脏穿刺采血，2 000 r/min离心15 min收集血清，用于心肌酶学、氧化应激及炎症因子指标研究。提取心肌组织总RNA用于mRNA表达分析。

1.5观察指标血清心肌酶学指标测定：取0.2 mL血清于全自动生化分析仪检测CK-MB和LDH水平。

1.5.1mRNA表达利用RNAiso Plus提取心肌组织总RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit将总RNA逆转成cDNA，通过SYBR®Premix Ex Taq进行real-time PCR检测，具体步骤按说明书操作。SOD、IL-6和GAPDH引物序列见表1。

表1　引物序列

1.5.2血清氧化应激及炎症因子指标测定黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD水平，硫代巴比妥酸法测定血清MDA水平，ELISA法测定血清IL-6水平，具体步骤按说明书操作。

2　结　果

2.13组小鼠血清心肌酶学指标比较阿霉素处理后小鼠出现心肌损伤，表现为心肌酶学指标CK-MB和LDH水平升高(P<0.05)，rhBNP组小鼠CK-MB和LDH水平较ADR组降低(P<0.05)。详见表2。

表2　各组血清心肌酶学指标比较(±s) 　U/L

2.23组小鼠心肌组织SOD和IL-6 mRNA水平比较阿霉素处理后小鼠心肌组织SOD mRNA水平降低(P<0.05)，IL-6 mRNA水平升高(P<0.05)，rhBNP组小鼠心肌组织SOD mRNA水平较ADR组升高(P<0.05)，但仍低于Control组(P<0.05)；而rhBNP组小鼠心肌组织IL-6 mRNA水平较ADR组降低(P<0.05)，但仍高于Control组(P<0.05)。详见图1。

注：与Control组相比，*P<0.05；与ADR组相比，#P<0.05。

2.33组小鼠血清氧化应激和炎症因子指标比较(见表3)阿霉素处理后小鼠血清SOD活性降低、MDA和IL-6的含量升高(P<0.05)，rhBNP治疗能提高SOD活性，降低MDA和IL-6的含量(P<0.05)，但不能恢复到正常小鼠水平(P<0.05)。

表3　各组小鼠血清氧化应激和炎症因子指标比较(±s)

3　讨　论

阿霉素是一种目前临床广泛应用并有效的蒽环类抗肿瘤药物，其抗肿瘤谱包括肺癌、乳腺癌、淋巴瘤等。但由于其剂量依赖性心肌毒性作用，严重的限制了临床应用的剂量与疗程。对于一些伴有慢性基础疾病的高龄病人，阿霉素的心肌毒性尤为敏感。阿霉素的心肌毒性表现为急性和慢性两种，急性心肌毒性表现为心肌损伤、心律失常和心力衰竭；慢性表现为慢性充血性心力衰竭。阿霉素的心肌损伤多为不可逆的，且预后极差。因此，寻找阿霉素的心肌保护性药物是一个有待解决的问题。

阿霉素导致心肌毒性的机制尚不完全明确，其中比较公认的是氧自由基学说。阿霉素和心肌组织的亲和力高，且其化学结构在代谢过程中易产生活性氧[7]。阿霉素会被内皮型一氧化氮合酶还原酶还原成半醌类中间产物，诱发活性氧产生，同时阿霉素能损伤线粒体DNA干扰呼吸链功能，释放更多的氧自由基[8]，此外，阿霉素能降低体内SOD等酶的活性，使氧自由基的清除受损。多因素下导致的氧自由基堆积，引起脂质过氧化，损伤细胞膜及细胞器膜，导致钙平衡紊乱、核酸蛋白合成抑制，从而影响心肌的舒缩功能。近年来，炎症反应在阿霉素心肌毒性中的作用日益受到关注。阿霉素能诱导炎症反应，导致多种炎症因子分泌的增加，包括白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和核转录因子(NF-κB)等[9-11]。此外有研究报道白细胞介素1(IL-1)受体拮抗剂预处理能够降低阿霉素所致的小鼠死亡，减轻心肌损伤[12]。

重组人脑利钠肽是利用基因生物工程技术人工合成的B型脑利钠肽。其与BNP具有相同的氨基酸序列、空间结构以及生物学功能，在心血管疾病治疗方面具有多重作用。主要包括：①与利钠肽结合，激活环磷酸鸟苷(cGMP)依赖的信号级联[13]；②扩张静脉、动脉和冠脉，降低心脏前后负荷[14]；③增加肾小球滤过率，抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统，利钠排尿[14]。

本研究观察小鼠心肌酶学改变、心肌组织SOD和IL-6 mRNA表达，以及血清SOD、MDA和IL-6水平变化，探讨rhBNP对阿霉素所致的小鼠急性心肌损伤的影响及可能机制。结果显示，小鼠在阿霉素注射后产生急性心肌损伤，表现为心肌酶学指标CK-MB和LDH水平升高，rhBNP治疗后心肌酶学指标明显下降。在氧化应激方面，阿霉素注射后小鼠心肌组织中SOD mRNA降低，血清SOD活性降低、MDA含量升高，rhBNP治疗能够升高SOD mRNA表达，提高血清SOD活性以及降低血清MDA含量。在炎症因子方面，阿霉素注射后小鼠心肌组织中IL-6 mRNA升高，血清IL-6分泌增加，rhBNP治疗能够抑制IL-6 mRNA表达和血清IL-6分泌。rhBNP治疗后能在一定程度上改善阿霉素所引起的小鼠心肌损伤、氧化应激及炎症反应。

本研究结果提示：rhBNP能够减轻阿霉素所致的急性心肌损伤，其具体机制可能是：①通过提高SOD表达和活性，对抗阿霉素所致的自由基堆积，减轻脂质过氧化，保护心肌细胞从而改善心肌舒缩功能；②通过降低心肌组织炎症反应，减轻炎症因子对心肌细胞的损伤，从而对抗阿霉素所致的心肌损伤。rhBNP通过以上机制起到对阿霉素所致的心肌损伤的保护，对于预防其化疗时心肌毒性、更好地发挥其抗肿瘤效果有着重要的意义。

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(本文编辑郭怀印)

1.湖南省第二人民医院(长沙 410007)；2.湖南省人民医院急救医学研究所

蒋宇，E-mail：jiangyu146@hotmail.com

R542.2R256.2

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2016．16．010

1672-1349(2016)16-1859-03

2015-12-03)